Untersuchungen zu Auswirkungen von GAG-Linkeropathien auf die ECM-Homöstase durch die Generierung von knockout-Modellen in Dermalfibroblasten

Kleine A (2024)
Bielefeld: Universität Bielefeld.

Bielefelder E-Dissertation | Deutsch
 
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OA 4.89 MB
Autor*in
Kleine, Anika
Gutachter*in / Betreuer*in
Abstract / Bemerkung
Proteoglykane (PG) sind essenzielle Bestandteile der extrazellulären Matrix (ECM) von Zellen und werden durch die kovalente Bindung von Glykosaminoglykanen (GAG) an ihre core-Proteine gebildet. Der Tetrasaccharid-Linker bildet das Bindeglied zwischen dem core-Protein des PGs und der repetitiven Disaccharidkette des GAGs und wird von vier Glykosyltransferasen synthetisiert. Im initialen, geschwindigkeitsbestimmenden Schritt überträgt die Xylosyltransferase (XT; XYLT1 und XYLT2) aktivierte Xylose auf einen definierten Serinrest im core-Protein. Als nächstes übertragen zwei Galaktosyltransferasen (GalT-I und GalT-II; B4GALT7 und B3GALT6) jeweils ein Galaktose-Molekül. Im finalen Schritt überträgt die Glukuronyltransferase (GlcAT-I; B3GAT3) eine Glukuronylsäure auf die terminale Galaktose. Mutationen in den Genen der an der Tetrasaccharid-Linker-Synthese beteiligten Glykosyltransferasen führen zu GAG-Linkeropathien mit multisystemischen Bindegewebs-veränderungen. Die XT tritt in allen höheren Organismen in Form von zwei homologen Isoformen (XT-I und XT-II) auf. Zur Analyse der Relevanz der beiden Isoenzyme wurde in dieser Arbeit erstmals ein massenspektrometrischer Assay zur simultanen und selektiven Quantifizierung der XT-I- und XT-II-Aktivität entwickelt. Mittels eines postulierten mathematischen Modells kann die jeweilige Aktivität der Isoenzyme aus den chromatographischen Daten bestimmt werden. Nach der Validierung des Assays konnten auch die enzymatischen Parameter KM und Vmax eruiert werden. Der entwickelte Assay ermöglicht die Analyse von humanen und murinen Zellkulturproben, sowie die Analyse von humanen Seren. Des Weiteren wurde die Quantifizierung der GalT-I-Aktivität als massenspektrometrische Methode für humane Zellkulturlysate etabliert und validiert. Zur Analyse der zugrunde liegenden molekularen Mechanismen bei GAG-Linkeropathien wurden im zweiten Teil dieser Arbeit erstmals CRISPR/Cas9-basierte knockout-Modelle aller an der Tetrasaccharid-Linker-Synthese beteiligten Transferasen in Dermalfibroblasten etabliert. Die Verifizierung der knockout-Systeme als geeignete in vitro Modelle erfolgte über den Vergleich eines generierten B3GALT6-knockouts mit B3GALT6-defizienten Patientenfibroblasten. Die einzelnen knockout-Systeme zeigten weitestgehend ähnliche Veränderungen in der ECM-Homöostase. Auffällig waren vor allem verminderte GAG-Konzentrationen, sowie eine stark verminderte Expression des PGs Aggrekan, dessen Funktionsstörung stark mit dem prominenten phänotypischen Merkmal des Kleinwuchses der Patienten assoziiert ist. Eine allgemeine Reduktion der Tetrasaccharid-Linker-Transferasen-Genexpressionen konnte ebenso detektiert werden, wie eine ubiquitäre Seneszenz-Induktion. Unsere Daten lassen eine unterschiedliche Regulation der beiden XT-Isoformen vermuten. Im dritten Teil dieser Arbeit wurden die Auswirkungen einer Defizienz beider XT-Isoformen auf den zellulären Metabolismus eruiert. Dabei konnte erstmals eine Induktion der Myofibroblasten-Differenzierung in Folge eines simultanen XYLT1/XYLT2-Doppel-knockdowns nachgewiesen werden. Durch Verwendung von Inhibitoren konnte außerdem gezeigt werden, dass die beobachtete, kompensatorische Myofibroblasten-Differenzierung durch das Zytokin TGF1 induziert wurde. Zusammengefasst konnten im Rahmen dieser Arbeit vielversprechende Modelle zum besseren Verständnis der Pathologie von GAG-Linkeropathien entwickelt werden. Die kurzfristige, sowie auch die langfristige Defizienz von Transferase-Genen führten zur gegenseitigen Reduktion aller Linker-Transferasen und geben Hinweise auf einen möglichen Multi-Enzym-Komplex mit gegenseitiger Regulation. Die dauerhafte Fehlproduktion der ECM löst Stressreaktionen bis hin zum Zellzyklusarrest in den Zellen aus. Nur der B3GALT6-knockout kann mittels eines in der Literatur postulierten rescue-Mechanismus über einen Trisaccharid-Linker die kompensatorische ECM-Produktion teilweise aufrechterhalten. Die Etablierung des XT-Isoform-selektiven massenspektrometrischen Aktivitätsassays ermöglicht zukünftig die wichtige Analyse der Relevanz zweier XT-Isoformen.
Jahr
2024
Seite(n)
186
Page URI
https://pub.uni-bielefeld.de/record/2987991

Zitieren

Kleine A. Untersuchungen zu Auswirkungen von GAG-Linkeropathien auf die ECM-Homöstase durch die Generierung von knockout-Modellen in Dermalfibroblasten. Bielefeld: Universität Bielefeld; 2024.
Kleine, A. (2024). Untersuchungen zu Auswirkungen von GAG-Linkeropathien auf die ECM-Homöstase durch die Generierung von knockout-Modellen in Dermalfibroblasten. Bielefeld: Universität Bielefeld.
Kleine, Anika. 2024. Untersuchungen zu Auswirkungen von GAG-Linkeropathien auf die ECM-Homöstase durch die Generierung von knockout-Modellen in Dermalfibroblasten. Bielefeld: Universität Bielefeld.
Kleine, A. (2024). Untersuchungen zu Auswirkungen von GAG-Linkeropathien auf die ECM-Homöstase durch die Generierung von knockout-Modellen in Dermalfibroblasten. Bielefeld: Universität Bielefeld.
Kleine, A., 2024. Untersuchungen zu Auswirkungen von GAG-Linkeropathien auf die ECM-Homöstase durch die Generierung von knockout-Modellen in Dermalfibroblasten, Bielefeld: Universität Bielefeld.
A. Kleine, Untersuchungen zu Auswirkungen von GAG-Linkeropathien auf die ECM-Homöstase durch die Generierung von knockout-Modellen in Dermalfibroblasten, Bielefeld: Universität Bielefeld, 2024.
Kleine, A.: Untersuchungen zu Auswirkungen von GAG-Linkeropathien auf die ECM-Homöstase durch die Generierung von knockout-Modellen in Dermalfibroblasten. Universität Bielefeld, Bielefeld (2024).
Kleine, Anika. Untersuchungen zu Auswirkungen von GAG-Linkeropathien auf die ECM-Homöstase durch die Generierung von knockout-Modellen in Dermalfibroblasten. Bielefeld: Universität Bielefeld, 2024.
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