PUB - Publikationen an der Universität Bielefeld

Das Sekundärmetabolit Acarbose wird weltweit in der klinischen Behandlung von Diabetes mellitus Typ 2 Patienten eingesetzt. Acarbose ist ein α-Glucosidase Inhibitor und hilft Patienten, ihren Blutzucker besser zu kontrollieren. Das Medikament ist seit 1990 kommerziell erhältlich und zählt zu den meistverkauften Antidiabetika. Das Sekundärmetabolit wird von Stämmen der Klasse Actinobacteria produziert, insbesondere von Actinoplanes sp. SE50/110 sowie vom Wildtyp abgeleiteten Stämmen.
In einem ersten Teil wurde die Biosynthese von Acarviostatin-Metaboliten im Acarboseproduzenten 1 (AP1) in Abhängigkeit zur C-Quelle analysiert. Dazu konnte eine Detektionsmethode entwickelt werden, um anschließend die Synthese von Acarviostatin- Metaboliten in AP1 bei Anzucht auf Minimalmedium mit unterschiedlichen Zuckern, respektive Maltose, Glucose, Galactose sowie Zuckermischungen, zu charakterisieren. Es wurde gezeigt, dass die Bildung von Acarbose und deren Homologen in Interdepen- denz zur Kohlenstoffquelle erfolgt. Außerdem werden immer mehrere Acarviostatin- Metabolite in unterschiedlichen Konzentrationen von der Zelle gebildet. Basierend auf den Messungen wurde ein Modell zur Bildung von Haupt- und Nebenkomponenten der Acarviostatin-Metabolite in AP1 entwickelt.
Im zweiten Teil der Arbeit wurde die Acarviostatin-Metabolit-Biosynthese in drei Acarboseproduzenten bei Anzucht auf Maltose- (Mal-MM) - sowie Maltotriose-Minimalmedium (MT-MM) betrachtet, sprich in Interdependenz zum Genotyp. Durch Vergleich der Genomsequenzen von AP1, AP2 und AP3 wurden Punktmutationen im Acarbosebiosynthesecluster identifiziert. Das Gen der Acarviosyltransferase AcbD ist von zwei Basen- transitionen betroffen, wobei eine in der Kodierung eines Stopcodons resultiert. Die iden- tifizierten Mutationen in acbD konnten auf Proteom-Ebene bestätigt werden. Aufgrund der zuvor etablierten Detektionsmethode konnte das Acarviostatin-Metabolit-Spektrum in AP1, AP2 und AP3 bei Anzucht auf Maltose- sowie Maltotriose-Minimalmedium charakterisiert werden. Diskrepanzen zur vorher postulierten C-Quellen-assoziierten Produktion der Acarviostatin-Metabolite zeigten sich für den Stamm AP3. Einerseits wurden unter Wachstum der Kultur auf Mal-MM (B) sowohl Acarviosyl-Maltose (Acarbose) als auch Acarviosyl-Maltotriose als Hauptkomponenten gebildet und andererseits zeigte sich bei Wuchs auf MT-MM (B) Acarviosyl-Maltose als einzige Hauptkomponente. Die in Teil 1 entwickelte Modellvorstellung wurde anschließend für die in der Arbeit betrachteten Stämme AP2 und AP3 erweitert. Dem Modell liegen dabei drei Grundannahmen zu Grunde:
I) die extrazelluläre Acarviosyltransferaseaktivität fehlt im Acarboseproduzenten 3,
II) innerhalb der Zelle erfolgt der Aufbau von Maltotriose aus Maltose durch eine Maltodextrin-Glucosidase und
III) Maltotriose kann im Acarboseproduzenten 2 und 3 nicht mehr aufgenommen werden.
Für die im Modell beschriebenen Stoffwechselwege konnten in den Genomsequenzen der drei Acarboseproduzenten Gene identifiziert werden, die für die gesuchten Synthese- und Transportprozesse kodieren können. Die vorliegende Dissertation analysiert damit erstmalig die Biosynthese von Acarviostatin-Metaboliten in Abhängigkeit von der C- Quelle im Kulturmedium sowie vom Genotyp des produzierenden Actinoplanes sp. SE50/110-Stammes.