PUB - Publikationen an der Universität Bielefeld

Weist das Genom eines Organismus einen Defekt in einem bestimmten Gen auf, der dessen Funktion komplett aufhebt, spricht man von einer sogenannten Knockout-Mutante. Diese sind ein unentbehrliches Werkzeug für die reverse Genetik, denn aus der Beobachtung der Mutante lassen sich Rückschlüsse auf die Funktion des defekten Gens ziehen. Die GABI-Kat-Kollektion wurde zu dem Zweck entwickelt, Zugriff auf knapp 72.000 potentiell interessante Knockout-Linien in Arabidopsis thaliana anzubieten. Zur Generierung der Linien wurde die durch Agrobacterium tumefaciens vermittelte Transformation verwendet, bei der ein Teil des Tumor-induzierenden (Ti)-Plasmids, die T-DNA, in das Genom des Wirts-Organismus an einer zufälligen Stelle stabil integriert wird und aufgrund ihrer Größe zum vollständigen Knockout eines dort kodierten Gens führen kann. Ein großer Vorteil gegenüber anderen Methoden zur Generierung von Knockouts ist, dass die Sequenz der integrierten T-DNA bekannt ist. So lassen sich Primer erstellen, mit denen Flanking Sequence Tags (FSTs) sequenziert werden können, die zur Insertion benachbarte Sequenzen beinhalten. Durch Analyse der Sequenzierergebnisse lassen sich Rückschlüsse auf den genauen Ort der Insertionen ziehen. Forscher können eine GABI-Kat Linie bestellen, die eine für sie interessante Insertion enthält. Daraufhin wird über eine klärende PCR und nachfolgende Sequenzierung die Anwesenheit der Insertion bestätigt und die Samen schließlich an den Besteller versendet. Im Rahmen dieser Arbeit wurden verschiedene Methoden innerhalb des GABI-Kat Projektes etabliert, um die Anzahl der bestätigten Insertionen zu erhöhen. Diese Methoden umfassten eine exaktere Vorhersage der FST-basierten Insertionsposition, die Einführung von Kontaminationsgruppen, um die richtige Linie unter identischen Vorhersagen in verschiedenen Linien zu identifizieren und die Aufklärung von schwerwiegenden Fehlern in der Zuordnung von FSTs. Außerdem wurden zwei Methoden zur Steigerung der Zuverlässigkeit von Analysen in paralogen Bereichen des Genoms entwickelt. Dies umfasste zum Einen paraloge Gruppen zur Aufklärung von Mehrdeutigkeiten in den Insertions-Vorhersagen und zum Anderen die Entwicklung eines Werkzeugs zur Generierung von eindeutigen Primern im Genom von A. thaliana. Diese Maßnahmen führten zu einem signifikanten Anstieg der Bestätigungsrate, die angibt, wie viele Insertionen experimentell bestätigt werden konnten von 78 % auf fast 88 %. Sie trugen maßgeblich dazu bei, dass möglichst viele Forscher die für sie interessanten Linien erhalten und unterstützten damit den wissenschaftlichen Informationsgewinn. Aufgrund von Duplikationen und daraus resultierenden paralogen Genen im Genom von Arabidopsis thaliana führen deren Knockouts in vielen Fällen nicht zwangsläufig zu einem sichtbaren Phänotyp. Durch mindestens eine zweite intakte Kopie, die die Funktion des defekten Gens teilweise oder komplett übernehmen kann, bleiben mögliche Auswirkungen des Knockouts oft unbemerkt. Um dieses Problem zu adressieren, wurde in dieser Arbeit eine Liste homologer Gene in A. thaliana berechnet anhand derer überprüft werden kann, ob der Knockout mehrerer Gene bei der Untersuchung eines Gens erforderlich ist. Anhand dieser Liste wurden 200 Doppelmutanten für vielversprechende Kandidaten-Paare durch Kreuzungen generiert. Bei der visuellen Analyse dieser Doppelmutanten zeigte sich eine deutliche Zunahme der beobachtbaren Phänotypen gegenüber Einzelmutanten. Die Informationen zu den Doppelmutanten und die Liste homologer Gene sind über eine im Internet verfügbare Benutzerschnittstelle verfügbar, die im Rahmen dieser Arbeit entwickelt wurde. Auf Basis einer großen Anzahl von Sequenzen, die aus der Bestätigung einzelner Insertionen in GABI-Kat stammen, konnten gemeinsame Charakteristika von T-DNA Insertionen aufgezeigt werden. Die Integration der T-DNA führt fast immer zu einer Veränderung der Ursprungssequenz in Form von kleineren Deletionen (ca. 1-50 bp) und kleineren Duplikationen (ca. 1-10 bp). In seltenen Fällen wurden auch Inversionen und große Deletionen von mehreren Kilobasen beobachtet. Am Übergang zwischen T-DNA und Kerngenom von A. thaliana finden sich normalerweise kürzere Bereiche von Mikrohomologie, die in Einzelfällen bis zu 20 bp groß sind, oder ein Filler, dessen Ursprung in den meisten Fällen im Genom von A. thaliana zu finden ist und der wiederum oft kurze Bereiche von Mikrohomologie zur jeweils benachbarten Sequenz aufweist. Des Weiteren ist die T-DNA häufig um einige Basen bezüglich der erwarteten Schnittstelle in der Border verkürzt. Alle diese Eigenschaften einer T-DNA Insertion deuten darauf hin, dass die Integration der T-DNA hauptsächlich mit Hilfe des Reparaturmechanismus NHEJ stattfindet. Aber auch die Beteiligung anderer Reparaturmechanismen wie MMEJ und SDSA ist wahrscheinlich. Diese Annahmen konnten in dieser Arbeit erstmals mit einer großen Fallzahl untersucht und belegt werden.