PUB - Publikationen an der Universität Bielefeld

Der technische und methodische Fortschritt auf dem Gebiet der Mikroskopie eröffnete die Möglichkeiten der Abbildung sehr kleinen Strukturen, u.a. auch subzellulärer Strukturen in lebendigen einzelligen Organismen. Die Beobachtung und Charakterisierung der subzellulären Lokalisierung von Proteinen kann Hinweise auf die Funktion der Proteine, sowie deren Interaktionspartner liefern. Die gesammelten Informationen zur räumlichen und zeitlichen Auflösung der Proteinlokalisierung in lebenden Organismen bieten die fehlende Komponente in der ganzheitlichen systembiologischen Aufklärung der Interaktionsnetzwerke eines Organismus. Im Rahmen dieser Arbeit ist eine Methode zur genomweiten Transposon-basierten Markierung von bakteriellen Proteinen mit Hilfe des eGFP (enhanced green fluorescent protein) entwickelt und etabliert worden. Für diesen Zweck wurde ein Transposon entwickelt, das ein egfp Gen ohne Start und Stoppkodon, mit der Neomycin/Kanamycin-Resistenz als Selektionsmarker beinhaltet. Der in Sinorhizobium meliloti nicht replizierende Vektor pHB14 trägt das Transposon, ebenso wie das Gen für die hyperaktive Form der Transposase unter der Kontrolle des trc-Promoters. Nach dem in vivo Transpositionsschritt entstehen im ersten Schritt, aufgrund des Stopp-Kodons im Selektionsmarkergen carboxyterminal-trunkierte Proteine. Im folgenden Schritt kann der Selektionsmarker dank der integrierten loxP Erkennungsstellen mittels Cre Rekombianse gezielt entfernt werden. Dafür werden die Transposon tragenden Stämme mit dem Vektor pHB15 transformiert, der die Cre-Rekombinase unter der Kontrolle eines durch Arabinose induzierbaren Promoters exprimiert. In Folge dessen entstehen intern in der Aminosäuresequenz mit eGFP markierte Proteine, die unter der Kontrolle der jeweiligen endogenen Regulationsmechanismen exprimiert werden. Mithilfe dieses Systems wurden mit der Transpositionseffizienz von 0,8% fluoreszent markierte S. meliloti Proteinfusionen erzeugt und sechzehn dieser zufällig markierten Proteine sind als „proof-of-principle“ identifiziert und mittels Fluoreszenzmikroskopie in lebenden kultivierten Zellen von S. meliloti, sowie während der Symbiose mit Medicago sativa dokumentiert worden. Die Ergebnisse zeugen von einer vielseitigen Proteinlokalisierungs-maschinerie in prokaryotischen Organismen und beweisen die simultane Nutzbarkeit der Methode für Expressions-, sowie Proteinlokalisierungsstudien. Zum ersten Mal wurde so die Lokalisierung von definierten Proteinen in ausdifferenzierten Bakteroiden, die aus den Wurzelknöllchen reisoliert wurden dokumentiert, sowie mit den Lokalisierungsmustern der jeweiligen Proteine unter Kultivierungsbedingungen verglichen. Damit konnte gezeigt werden, dass auch in den hoch spezialisierten Bakteroiden eine strikte Verteilung der essentiellen Proteine vorliegt, die in einigen Fällen von der Lokalisierung in kultivierten Bakterien abweicht, was in den veränderten Bedingungen der Umgebung, sowie der spezialisierten Funktionen der Bakteroide begründet ist.