PUB - Publikationen an der Universität Bielefeld

In dieser Arbeit wird ein kombiniertes Rasterionenleitfähigkeits-/Weitfeldfluoreszenzmikroskop entwickelt. Die Zusammenführung der verschiedenen Techniken erlaubt das Erforschen neuer, unkonventioneller Methoden in der Biophysik. Die Weitfeldfluoreszenzmikroskopie bietet in Kombination mit hochauflösenden Techniken die Möglichkeit, biologische Proben passiv mit Hilfe fluoreszierender Farbstoffe mit bisher ungeahnter Schärfe zu beobachten. Über die Rasterionenleitfähigkeitsmikroskopie (Scanning Ion Conductance Microscopy, SICM) können topographische Informationen von nicht leitenden Proben erhalten werden. Neben der ursprünglichen Verwendung kann das SICM über die funktionalisierte Nanopipette mit einem Öffnungsdurchmesser von 60 nm auch als aktiver Manipulator von weichen Proben eingesetzt werden. Die Kombination von Fluoreszenzmikroskopie und SICM bietet daher vor allem für die Biophysik neue Möglichkeiten der Beobachtung sowie der aktiven Manipulation von Proben auf mikroskopischer Ebene. Neben dem Aufbau der kombinierten Mikroskope wurde für die SICM Technik eine optimierte Softwareroutine entwickelt, welche die Zeit, die ein SICM benötigt, um topographische Informationen von Proben zu bekommen auf 2/3 der ursprünglichen Zeit reduziert. Für eine aktive Nutzung der Nanopipette wird eine neue Softwaresteuerung entwickelt, die eine Subnanometersteuerung einer Pipette erlaubt. Weiterhin wurden leitende Oberflächen mit einer sehr planen, transparenten Struktur entwickelt, die ein hochpräzises punktförmiges Ablegen von Farbstoffmolekülen mit Hilfe der Nanopipette nahe der Auflösungsgrenze von Fluoreszenzmikroskopen ermöglichten. Des Weiteren bieten die Oberflächen die Vorteile einer mehrfachen Verwendbarkeit und die Möglichkeit die erzeugten Strukturen über die dSTORM Technik unterhalb der Beugungsgrenze aufzulösen. Neben der Erzeugung fluoreszenter Referenzstrukturen ist eine weitere Anwendung der funktionalisierten Nanopipette das direkte Injizieren von Farbstoffmolekülen und farbstoffbasierten Sonden in lebende Zellen über Elektrophorese. Es wird gezeigt, dass verschiedene Farbstoffe in eine Zelle nahezu instantan eingebracht werden können, ohne die Apoptose der Zelle durch den invasiven Vorgang auszulösen. Des Weiteren werden Strukturmarkierungen innerhalb von lebenden Zellen über das Einbringen von Antikörpern und Proteinen die sich an spezifische Strukturen einer Zelle binden, sowie die Beobachtung von dynamischen Prozessen mittels Fluoreszenzmikroskopie in lebenden Zellen gezeigt.