PUB - Publikationen an der Universität Bielefeld

In der vorliegenden Arbeit wurde ein 2-Photonenmikroskop mit multiplen Detektionsmethoden betrieben und für verschiedene Anwendungen verwendet und ausgebaut. Mit den vorgestellten non-descanned Detektionsmethoden können dreidimensionale Intensitätsaufnahmen erstellt werden. Die Detektion mit der EMCCD-Kamera bietet den Vorteil der Verwendung von multiplen Anregungsfoki und somit einer hohen Aufnahmegeschwindigkeit.Die Detektion mit einem PMT ist hingegen auf einen Anregungsfokus beschränkt, erzielt jedoch ein besseres S/N-Verhältnis. Vor allem bei einer großen Eindringtiefe in stark streuenden Proben ist diese Detektionsmethode zu bevorzugen. Eine spektrale Auswertung des Fluoreszenzsignals kann durch die selektive Verwendung von Bandpassfiltern im Detektionspfad sowohl mit der Kamera als auch mit dem PMT durchgeführt werden. Die lange Aufnahmezeit bei der Verwendung des PMT kann zu Zerstörungsmechanismen in der Probe sowie zum Ausbleichen des Fluoreszenzfarbstoffs führen. Deutlich zeiteffizienter ist die multifokale, multispektrale descanned Detektionsmethode.Mit dieser Methode werden acht Bilderstapel gleichzeitig aufgenommen, die jeweils aus acht spektralen Kanälen bestehen. Allerdings erfordert diese Detektion eine anschließende, externe Bildverarbeitung. Gegenüber der non-descanned Kameradetektion wird ein höheres S/N-Verhältnis erreicht. Die zusätzlich detektierte, spektrale Information wird dazu genutzt, Fluorophore voneinander zu unterscheiden und somit individuell markierte oder autofluoreszierende Kompartimente einer Probe zu unterscheiden. Eine weitere Möglichkeit der Unterscheidung von Fluorophoren ist die Auswertung der Fluoreszenzlebensdauer. Mit dem installierten TCSPC-System ist es möglich, Fluoreszenz-Lebenszeit-Imaging durchzuführen. Die beiden Hauptanwendungen des Systems waren die Bewertung von humanem Knorpelgewebe sowie die Untersuchung von Proteindynamiken in Pflanzenzellen. Humanes Knorpelgewebe kann mittels 2-Photonen Mikroskopie analysiert werden. Sowohl die extrazelluläre Matrix als auch die in der Matrix eingebetteten Chondrozyten erzeugen ein Fluoreszenzsignal. Eine Differenzierung der extrazellulären Matrix gegenüber den Zellen wurde über die unterschiedlichen Fluoreszenzspektren sowie über die unterschiedlichen Fluoreszenzlebensdauern gezeigt. Die zentrale Fragestellung war die Klassifizierung von Knorpelgewebe in bestehende Bewertungsschemata für Arthrosestadien anhand von 2-Photonen Fluoreszenzaufnahmen. In diesem Zusammenhang konnte die Fluoreszenzintensität als ein charakteristischer Parameter für die Knorpeldegeneration identifiziert werden. Darüber hinaus konnte festgestellt werden, dass die Morphologie der Mikroskopbilder den makroskopischen, klinischen Befunden sehr ähneln. Um eine automatisierte, objektive Klassifizierung zu erzielen, wurde eine Analyse der Bildtexturen angewendet. Diese beruht auf der Erzeugung von mehrdimensionalen Merkmalsräumen mittels diskreter Wavelet-Transformation. Die Auswertung dieser Merkmale erfolgte mit selbstorganisierenden Karten. Auf diese Weise konnte eine Klassifizierung in vier Arthrosestadien erzielt werden, die in bisherigen Vergleichen zu makroskopischen Befunden sehr gut übereinstimmt. Um die Anwendung der Knorpelklassifizierung weiter in die Richtung der klinischen Anwendung zu bringen, wurde zudem ein mikroendoskopisches 2-Photonen System in das bestehende Mikroskopsystem integriert. Ein Faserbündel mit einem miniaturisierten Objektiv wurde für die bewegliche Lichtführung verwendet. Die auftretende Dispersion in einem solchen Faserbündel hat eine verlängernde Auswirkung auf ultrakurze Laserpulse. Um die 2-Photonenabsorption auch mit dieser Methode zu ermöglichen, wurde ein zusätzlicher Pulskompressor aus optischen Reflexionsgittern aufgebaut. Es konnten erste 2-Photonenbilder erzeugt werden. Für die Untersuchung von Proteindynamiken wurde eine Methode entwickelt, um die Transportprozesse von Proteinen in Pflanzenzellen untersuchen zu können. Der an Proteine gekoppelte photoaktivierbare Farbstoff pa-GFP wurde in selektiven ROI`s aktiviert und die Ausbreitungsdynamik durch Fluoreszenzmikroskopie verfolgt. Auf diese Weise konnten Transportvorgänge zwischen dem Zellkern und dem Zytosol der Zelle von HMGB2/3 Proteinen nachgewiesen werden.