PUB - Publikationen an der Universität Bielefeld

Die Aktivierung der B-Zellen ist ein exakt regulierter Prozess, der vor allem von dem B-Zell-Rezeptor-(BCR-)Komplex gesteuert wird. Die assoziierten Ig[alpha]- und Ig[beta]-Ketten befähigen das membranständige Immunglobulin, das Zellinnere von der Antigenbindung zu unterrichten und damit die B-Zell-Proliferation und Differenzierung ruhender B-Zellen zu antikörpersezenierenden Plasmazellen zu initiieren. Die von B-Zellen exprimierten Oberflächenmoleküle unterliegen der Kontrolle dieses Aktivierungsprozesses. Die Regulation von Fc[gamma]RIIb1, der eine wichtige Funktion bei der Termination der B-Zell-Antwort ausübt, wurde im Vergleich mit der Fc[gamma]RIIb2-Isoform an der FcR-negativen Maus B-Zelllinie IIA1.6 durch stabile Expression von unserem Labor erfolgreich untersucht. Um die Bedeutung beider ITAM-tragenden Ig[alpha]- und Ig[beta]-Ketten in der negativen Signaltransduktion analysieren zu können, wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit ein Chimärrezeptor IgM/Ig[alpha] zusätzlich in die Fc[gamma]RIIb1- und Fc[gamma]RIIb2-exprimierenden Zellen transfiziert. Der Einfluss beider Fc[gamma]RIIb-Isoformen auf die Ig[alpha]-vermittelten Signale wurde im direkten Vergleich mit der Fc[gamma]RIIb-Coquervernetzung mit dem IgM/Ig[beta] näher untersucht. Es konnte erstmals gezeigt werden, dass Ig[alpha] und Ig[beta] eine unterschiedliche Rolle in der Fc[gamma]RIIb-vermittelten Signalkaskade spielen. Die Fc[gamma]RIIb-Coquervernetzung mit dem Chimärrezeptor führte nur in IgM/Ig[beta]-, aber nicht IgM/Ig[alpha]-exprimierenden Zellen zur Tyrosinphosphorylierung des ITIMs von Fc[gamma]RIIb1. Jedoch hemmten beide Fc[gamma]RIIb-Isoformen den IgM/Ig[alpha] bzw. IgM/Ig[beta] induzierten Calciumeinstrom. Diese Ergebnisse stimmen mit den von unserem Labor bereits publizierten Daten überein, dass die Hemmung des Öffnens der Plasmamembrancalciumkanäle unabhängig von der Tyrosinphosphorylierung des ITIMs vermittelt wird. Trotz Pervanadat/H2O2-Inhibierung der Phosphatasen war die ITIM-Tyrosinphosphorylierung bei der Coquervernetzung von IgM/Ig[alpha] und Fc[gamma]RIIb nicht detektierbar. Es ist also möglich, dass die Tyrosinkinase(n), die für die Phosphorylierung von Fc[gamma]RIIb1 verantwortlich ist/sind, nur in Anwesenheit von Ig[beta] rekrutiert wird/werden. In Untersuchungen von endogenen Ig[alpha] und Ig[beta] bei Coquervernetzung des membranständigen IgGs und Fc[gamma]RIIb1 zeigten beide Ketten eine reduzierte Tyrosinphosphorylierung im Vergleich zur BCR-Vernetzung. Eine ähnliche Phosphorylierungskinetik konnte nicht bei der Fc[gamma]RIIb1-Coquervernetzung von IgM/Ig[alpha] beobachtet werden. Dies deutet auf die Beteiligung einer tyrosinspezifischen Phosphatase und eine essentielle Bedeutung von Ig[beta] für die Initiation der Fc[gamma]RIIb1-vermittelten Signalkaskaden hin. In der Fc[gamma]RIIb1-vermittelten Signaltransduktion ist eine SH2-Domäne enthaltende Inositol Polyphosphat 5'-Phosphatase (SHIP) beteiligt. SHIP hydrolysiert selektiv PI-3,4,5-P3 und in vitro I-1,3,4,5-P4, die beide eine wichtige Rolle in dem Calciumsignalweg spielen. SHIP wird nach der Fc[gamma]RIIb1-Coquervernetzung mit dem BCR von dem phosphorylierten ITIM rekrutiert, anschließend tyrosinphosphoryliert und assoziiert mit einer Reihe von signalübermittelnden Proteinen. Um die SHIP-Proteine genauer analysieren zu können, wurden im zweiten Teil dieser Arbeit rekombinante SH2-Domänen und katalytische Domänen von SHIP in E. coli exprimiert und polyklonale Antikörper hergestellt. Beide Antikörper sind für Western Blot geeignet, jedoch nicht zum Präzipitieren von endogenem SHIP. Die Assoziation von SHIP über dessen prolinreichen C-Terminus mit rekombinanten SH3-Domänen von Lyn, PI3-Kinase und SH3P7 konnten neben der bekannten SHIP:Grb2- und SHIP:Src-Wechselwirkungen in beiden stimulierten und unstimulierten IIA1.6-Zellen nachgewiesen werden. Für weitere Untersuchungen an SHIP in sowohl der positiven als auch der negativen Signalübermittlung der B-Zelle ist meiner Meinung nach ein neues effizienteres Modellsystem erforderlich, da die SHIP-mRNA-Mengen in IIA1.6-Zellen mit der Kultivierung offensichtlich variieren können, so dass dies die SHIP-Überexpression und die Antisense-Expression erschweren.