PUB - Publikationen an der Universität Bielefeld

Der Gram-positive phytopathogene Bakterienstamm Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (Cmm) besiedelt das Xylem seiner Wirtspflanze Solanum lycopersicum (Tomate) und führt zur unifazialen Fiederblattwelke, zu Sprossläsionen und letztlich zum Absterben der Pflanzen. Für die Krankheitsauslösung direkt verantworlich sind die plasmidkodierten Pathogenitätsfaktoren Pat-1, lokalisiert auf pCM2 (72 kb), und CelA, lokalisiert auf pCM1 (27,2 kb). Da ein plasmidfreier Stamm (Curingderivat CMM100) als Endophyt im Xylem der Tomate persistieren kann und keine Krankheit auslöst, sind Gene, die die Kolonisation der Tomate ermöglichen, chromosomal kodiert. In einem vorangegangenen Shotgun-Sequenzierungsprojekt wurde das für "Bacterioferritin comigratory protein" (Bcp) kodierende Gen bcp identifiziert. Bcp gehört zur Familie der Alkylhydroperoxid-Reduktase C/Thiol-spezifische antioxidative Proteine (AhpC/TSA), auch Peroxiredoxine (Prx) genannt. AhpC/TSA-Proteine besitzen Peroxidaseaktivität für H2O2 und organische Hydroperoxide. Diese reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) werden in kompatiblen und inkompatiblen Bakterien-Pflanzen-Interaktionen im Verlauf des "oxidative burst", einer Antwort auf den Pathogenbefall von Pflanzen, freigesetzt. In dieser Arbeit wurde mittels Insertionsmutagenese eine bcp--Mutante von Cmm hergestellt. Die bcp--Mutante zeigte in Flüssigkultur und auf der Agarplatte kein verändertes Wachstum. Im Pflanzentest mit der Tomate führt die bcp--Mutante wie der Kontrollstamm CMM101 zu Welkesymptomen. Zusätzlich ist ein Effekt der bcp--Mutante auf das Pflanzenwachstum zu beobachten. Die mit der bcp--Mutante infizierten Tomatenpflanzen sind kleiner als die mit dem Kontrollstamm infizierten Pflanzen. Die Komplementation der Mutante mit dem intakten bcp-Gen stellte im Pflanzentest den Phänotyp des Kontrollstammes CMM101 wieder her. In der Hypersensitiven Reaktion (HR) mit der Nichtwirtspflanze Mirabilis jalapa konnten keine Unterschiede zwischen der bcp--Mutante und den Kontrollstämmen festgestellt werden. Im zweiten Teil der Arbeit wurde heterolog überexprimiertes, gereinigtes Bcp-Protein hinsichtlich seiner Konformation in reduzierter und nicht-reduzierter Form analysiert. Bcp besitzt N-terminal zwei konservierte reaktive Cysteine. Die durch ortsspezifische Mutagenese und Überexpression erhaltenen Bcp-Varianten C49S und C54S sowie das ebenfalls gereinigte Bcp-Homolog AhpE wurden gleichermaßen bezüglich ihrer Konformation untersucht. Bcp wurde als atypisches 2-Cys Prx bestätigt, AhpE gehört vermutlich zur Klasse der typischen 2-Cys Prx. Die Überprüfung der Peroxidase-Aktivität mittels FOX-Test zeigte für Bcp eine Thioredoxin- und DTT-unabhängige Aktivität für H2O2, hingegen eine Thioredoxin-abhängige Aktivität für Cumenehydroperoxid. t-Butylhydroperoxid und Linolsäurehydroperoxid werden durch Bcp nicht zu den entsprechenden Alkoholen umgesetzt. Cystein49 konnte als primär reaktives Cystein identifiziert werden. Für AhpE wurden Thioredoxin-abhängige Peroxidase-Aktivitäten mit Präferenz für Cumenehydroperoxid vor H2O2 und mit etwa gleicher Aktivität Linolsäurehydroperoxid und t-Butylhydroperoxid bestimmt. Die Peroxidase-Aktivitäten von Bcp und AhpE sind damit redundant in Cmm vorhanden. Die Ergebnisse der Pflanzentests sowie die Daten für die Peroxidaseaktivität deuten auf eine Beteiligung von Bcp im Frühstadium der Kolonisation der Wirtspflanze hin.