PUB - Publikationen an der Universität Bielefeld

Die hier vorgestellte Arbeit beschäftigt sich mit der Verbesserung der multifokalen Zwei-Photonen-Laser-Raster-Mikroskopie (TPLSM) im Hinblick auf die Beschleunigung der Datenaufnahme und die Erhöhung der Empfindlichkeit und demonstriert an einigen exemplarischen Experimenten die Anwendungsvielfalt der multifokalen TPLSM. Der theoretische Teil zeigt zunächst die Auswirkung der Anwendung des Zwei-Photonen-Anregungsprozesses in der Mikroskopie. Mit Hilfe bekannter Größen aus der linearen Optik wird auch ohne quantenmechanische Rechnungen der große Vorteil der TPLSM verständlich, der darin besteht, dass die Anregung der Fluorophore nur auf das Fokusvolumen beschränkt ist. Des weiteren werden im theoretischen Teil die Grundlagen des Parallel-Processings als der grundlegenden Technologie für die beschleunigte Datenaufnahme diskutiert. Der experimentelle Teil der Arbeit zeigt die Vielzahl der Anwendungsmöglichkeiten der multifokalen TPLSM in Biologie, Chemie und Physik. Die multifokale Multiphotonen-Mikroskopie bietet viele Vorteile gegenüber der bisher genutzten konfokalen Laser-Raster-Mikroskopie und der einstrahligen Multiphotonen-Mikroskopie. Insbesondere der Geschwindigkeitsvorteil der multifokalen TPLSM ist für biologische Untersuchungen wichtig, um die in lebenden Zellen ablaufenden Prozesse auf neuen Zeitskalen untersuchen zu können. Zudem kann mit der multifokalen TPLSM eine neue Technologie zur flächigen Anregung ohne Rastern realisiert werden, die mit einem konventionellen einstrahligen TPLSM prinzipiell nicht realisierbar ist. Nach der Demonstration der grundsätzlichen Anwendbarkeit von Quantendots in der TPLSM kann mit Hilfe der Quantendots die Detektionseffizienz und die maximal erreichbare Auflösung des hier realisierten multifokalen TPLSM-Aufbaus bestimmt werden. Bei einem Experiment aus dem Bereich der Chemie zur Biomineralisation kann die multifokale TPLSM die Struktur aufklären, wenn das aus zwei flüssigen Phasen bestehende Modellsystem durch die grundlegende Reaktion seine Morphologie ändert. Im Bereich der Biologie wurden zwei Experimente mit Hilfe der multifokalen TPLSM durchgeführt. Für die Untersuchung der Transportphänomene von Vesikeln in lebenden Pflanzenzellen werden GFP-fusionierte Proteine verwendet, die an den Golgi-Apparaten aggregieren und so die Bewegung der Golgi-Apparate entlang des Netzwerkes des Endoplasmatischen Retikulums sichtbar machen. Die Bewegung lässt sich quantifizieren und durch die Anwendung von Inhibitoren weiter spezifizieren. Bei den neurophysiologischen Untersuchungen kann die TPLSM erfolgreich zur in vivo-Messung der Kalzium-Dynamik in lebenden Nervenzellen des visuellen Systems einer Fliege bei optischer Stimulation angewendet werden. Hierbei werden die Vor- und Nachteile der verschiedenen Betriebsmodi des TPLSM bezüglich der räumlichen und zeitlichen Auflösung sowie der Möglichkeit zur Bildgebung diskutiert.