PUB - Publikationen an der Universität Bielefeld

Das Ziel dieser Arbeit bestand in der in vivo Lokalisierung von regulatorischen und strukturellen Bestandteilen von COPI-coated Vesikeln in der Modellleguminose Medicago truncatula, um ein Modell für deren Funktion in Pflanzen entwickeln zu können. Die Arbeit war in drei aufeinanderfolgende Schritte gegliedert. Der erste Schritt bestand in der Identifizierung von Homologen für Coatomerprotein-Untereinheiten, die bekanntermaßen die Proteinhülle von COPI-coated Vesikeln bilden, durch Recherche in M. truncatula EST-Datenbanken. Bis zu Beginn dieser Arbeit war für M. truncatula keine einzige Sequenz für ein Coatomerprotein beschrieben worden. Mittels der EST-Datenbanksuche konnten verschiedene homologe EST-Sequenzen für alle sieben der bekannten Untereinheiten identifiziert werden. Diese überdeckten den jeweiligen hypothetischen open reading frame (ORF) zu mindestens 75 Prozent und wiesen hohe Homologie zu Coatomer-Untereinheiten aus dem pflanzlichen und tierischen System auf. Im zweiten Schritt wurden Sequenzen für das kleine G-Protein Arf1, das die Bildung von COPI-coated Vesikeln reguliert, und für die Coatomerproteine [epsilon]-COP, [zeta]-COP1 und [zeta]-COP2 aus M. truncatula cDNA-Banken isoliert und heterolog in E. coli als native und als GFP-fusionierte Proteine exprimiert. Die Produkte wurden nach Aufreinigung durch Affinitätschromatographie mit Trypsin verdaut und mittels MALDI-TOF MS untersucht. Im dritten Schritt wurde die in vivo Lokalisierung der GFP-fusionierten Proteine Arf1, [zeta]-COP1 und [zeta]-COP2 in "hairy root" transformierten Wurzeln von M. truncatula untersucht. Diese konnten an fluoreszenten Strukturen lokalisiert werden, die sich aktiv durch das Cytoplasma der Wurzelzellen bewegten. Das Bewegungsmuster bestand dabei aus Phasen aktiven Strömens, unterbrochen durch Pausen, in denen sich die Strukturen nicht bewegten. Durch Inkubation transgener Wurzeln mit MitoTracker konnte eine Lokalisierung der Konstrukte an Mitochondrien ausgeschlossen werden. Die Anwendung des Membranfarbstoffs FM4-64 hingegen führte zu einer Kolokalisation mit den fluoreszenten Strukturen, was auf eine Lokalisation an membranumhüllten Kompartimenten schließen ließ. Die Applikation von Nocodazol, eines Mikrotubuli-Inhibitors, hatte keinen Einfluss auf die Strömungsaktivität der fluoreszenten Strukturen, während die Zugabe von Latrunculin B, eines Aktin-Inhibitors, die Bewegung komplett inhibierte. Die Strömung wurde daher abhängig von intakten Aktin-Filamenten, nicht aber von Mikrotubuli gefunden. Die Koinkubation transgener Wurzeln mit ER-Tracker führte weiterhin zu dem Ergebnis, dass sich die Strukturen entlang von ER-Tubuli bewegten. Zusammengenommen deuten diese Resultate auf eine Lokalisierung der Konstrukte am Golgi-Apparat hin. Diese Vermutung konnte durch Applikation von Brefeldin A (BFA), einem potenten Inhibitor der regulatorischen GTPase Arf1, bestätigt werden. Brefeldin A induziert drastische Veränderungen der Morphologie des Golgi-Apparates durch Hemmung von Vesikeltransportprozessen. Die Zugabe des Inhibitors zu transgenen Wurzeln führte zu einer Aggregation fluoreszenter Strukturen, deren Akkumulation um den Zellkern herum und inhibierte teilweise deren Bewegungsaktivität. Arf1, [zeta]-COP1 und [zeta]-COP2 konnten daher am Golgi-Apparat lokalisiert werden. Die Vesikel selbst konnten allerdings mit keinem der verwendeten Konstrukte detektiert werden. Erst die Transformation einer konstitutiv aktiven Mutante des kleinen G-Proteins Arf1 (Arf1 Q71L) induzierte im Cytosol transgener Wurzelzellen die Akkumulation von kleinen granulären, fluoreszenten Strukturen, die als COPI-coated Vesikel interpretiert werden können.