PUB - Publikationen an der Universität Bielefeld

Die pflanzliche V-ATPase energetisiert in Pflanzen durch die ATP-verbrauchende Katalyse des Protonenflusses zahlreiche sekundär aktive Transportprozesse an Biomembranen. Der Multiproteinkomplex der V-ATPase besteht aus 12 Untereinheiten. In der vorliegenden Arbeit erfolgte erstmals die Klonierung der Volllängen der die Untereinheiten A, B, G, H, a, d und e codierenden cDNA-Sequenzen der halotoleranten, fakultativen CAM-Pflanze Mesembryanthemum crystallinum. Zusammen mit den Sequenzen der Untereinheiten C, E, F und c ist damit erstmals der nahezu gesamte Satz an Untereinheiten-Sequenzen der funktionellen V-ATPase bei einer halophytischen Pflanze zugänglich. Durch Sequenzvergleiche mit den V-ATPase-Untereinheiten von Arabidopsis thaliana und Saccharomyces cerevisiae konnten die Untereinheiten einem Vergleich auf funktionaler Ebene zwischen Pflanzen und Hefe, sowie zwischen dem Glykophten A. thaliana und dem Halophyten M. crystallinum durchgeführt werden. Der Sequenzvergleich erlaubte erste funktionale Rückschlüsse. So erwies sich, dass die Mechanismen der für die Hydrolyse des ATP und des Protonentransportes verantwortlichen Aminosäuresequenzen der V-ATPase über die Arten hinweg hochkonserviert sind, soweit dies von den Aminosäuresequenzen her geschlossen werden kann. Mit cDNA-basierten Arrays wurden bei M. crystallinum stressbedingte Transkriptmengenänderungen der Untereinheiten im Vergleich zu den Transkriptspiegeln der tonoplastidären Pyrophosphatase und der Plasmamembran-ATPase untersucht. Es zeigte sich, dass in Reaktion auf eine sechsstündige Applikation fünf verschiedener Modalitäten von Stress die Mengen der V-ATPase-Untereinheiten-Transkripte sowohl organspezifisch als auch in Bezug auf den gegebenen Stress differenziell geregelt werden. Die stärksten Effekte auf die Expression der Untereinheiten zeigten sich bei Salzstress. Die Ergebnisse der Charakterisierung der Untereinheiten und der Mechanismus der Regulation der Transkriptmengen lassen erkennen, dass eine Reaktion auf Salzstress wohl überwiegend in einer vermehrten Expression von V-ATPase-Genen besteht. Die am stärksten positiv regulierten Untereinheiten verfügen über ein "Back-up"-System durch mehrere vorhandene Isogene, deren Transkriptmengen bei Bedarf kurzfristig erhöht werden können. Zur näheren Charakterisierung der Untereinheit a in Pflanzen wurde der cytoplasmatische N-Terminus heterolog exprimiert, aufgereinigt und zur Herstellung eines Antiserums verwendet. Durch immuncytochemische Untersuchungen an Maiswurzelzellen konnte eine Lokalisation von VHA-A und -E am glatten endoplasmatischen Reticulum, am Golgi-Apparat und am Tonoplasten gezeigt werden. Diese Ergebnisse belegen, dass wie in der Hefe auch in der pflanzlichen Zelle die einzelnen Isoformen der Untereinheit a in verschiedenen Kompartimenten des sekretorischen Wegs und des Tonoplasten lokalisiert sind.