PUB - Publikationen an der Universität Bielefeld

Die Grundlage der vorliegenden Arbeit war die molekularbiologische Charakterisierung der Funktion des an der Galactoglucan-Biosynthese (EPS II) beteiligten transkriptionellen Aktivators ExpG aus Sinorhizobium meliloti. Das ExpG-Protein zeigt Ähnlichkeiten zu Transkriptionsregulatoren der MarR-Familie, die an die DNA mittels eines helix-turn-helix (HTH)-Motivs binden. Das expG-Genprodukt weist ein C-terminales HTH-MarR-Motiv auf. Im Rahmen der Untersuchungen wurde ExpG als N-terminales und C-terminales His6-Fusionsprotein in Escherichia coli heterolog exprimiert. Durch Sequenzvergleich konnte eine AT-reiche, 21 bp umfassende palindromische Kernregion in den Promotorregionen vor dem expA-, expE- und expD-Operon sowie vor dem expG-Gen identifiziert werden. Mit Box1 und Box2 wurden zwei weitere Bereiche, die hohe Übereinstimmungen zeigen, stromaufwärts bzw. stromabwärts dieser Kernregion lokalisiert. Nach affinitätschromatographischer Aufreinigung des jeweiligen Fusionsproteins konnte eine direkte Bindung an die exp-Promotorregionen nachgewiesen werden. Die Aktivierung der Transkription der EPS II-Biosynthesegene erfolgt durch die spezifische Bindung von ExpG an die expA1- und expE1-Promotorregionen sowie an die intergenische Region zwischen expG und expD. Die palindromische Kernregion ist essentiell für diese Protein-DNA-Interaktion, die aber erst vollständig durch die vermutlich stabilisierende Wirkung der beiden Motive Box1 und Box2 ermöglicht wird. Aus den in dieser Arbeit ermittelten Assoziations- und Dissoziationsraten ließen sich Dissoziationskonstanten für die ExpG-DNA-Komplexe errechnen, die vergleichbar zu transkriptionellen Regulatoren aus anderen Protein-Familien sind. Im zweiten Teil dieser Arbeit konnte durch Promotoranalysen die komplexe Regulation der exp-Genexpression durch MucR, PhoB und ExpG weiter aufgeklärt werden. Die Überlappung der ExpG-Bindestellen mit den potentiellen PHO Boxen in den exp-Promotorregionen lässt auf ein Zusammenspiel der beiden Regulatoren ExpG und PhoB schließen. Der regulatorische Einfluss von MucR erfolgt vermutlich indirekt über die zusätzlich identifizierte palindromische Sequenz in den expA1- und expE1-Promotorregionen, die möglicherweise als Bindestelle für ein weiteres regulatorisches Protein fungiert. Basierend auf den Ergebnissen der untersuchten Promotorregionen im Wildtyp-, phoB-, mucR-, [Delta]G- und [Delta]G/mucR-Hintergrund ließ sich ein Modell zur komplexen Regulation der Transkription der Galactoglucan-Biosynthesegene sowohl unter Phosphat-suffizienten als auch unter Phosphat-limitierenden Bedingungen entwickeln. Der transkriptionelle Regulator ExpG kann bei Phosphatmangel und bei ausreichenden Phosphatkonzentrationen zum einen als Aktivator und zum anderen als Repressor auf die potentiellen Promotoren in den exp-Promotorregionen wirken. Der reprimierende Einfluss des zentralen Regulators MucR wird sehr wahrscheinlich durch den kooperativen Effekt von PhoB und ExpG unter Phosphat-limitierenden Bedingungen teilweise wieder aufgehoben und es erfolgt die Aktivierung der Galactoglucan-Biosynthese.