PUB - Publikationen an der Universität Bielefeld

Proteine sind an nahezu allen zellulären Prozessen beteiligt. Als Enzyme katalysieren sie Reaktionen, sie bilden Strukturen in Zellen, Organen und Geweben, und nicht zuletzt kontrollieren sie viele Prozesse im Organismus. Alle Proteine sind genetisch codiert und ihre Biosynthese wird durch eine Vielzahl von Faktoren beeinflusst. Letztlich erfolgt die Steuerung der Biosynthese von Proteinen über eine Kontrolle der Transkription der DNA zur mRNA. Die Transkription wird über Transkriptionsfaktoren positiv (Transkriptionsaktivatoren) oder negativ (Transkriptionsinhibitoren) reguliert. Auch die Transkriptionsfaktoren sind Proteine, die mit der DNA interagieren. Diese Wechselwirkungen müssen sehr spezifisch sein, da schließlich nur ein bestimmtes Gen zur Expression einer bestimmten mRNA und damit zur Produktion eines bestimmten Proteins aktiviert werden darf. Die Kontrolle der Biosynthese von Proteinen, die an pathologischen Prozessen beteiligt sind, würde es ermöglichen, in diese Prozesse regulierend einzugreifen. Es wäre also sehr wünschenswert, künstliche Transkriptionsfaktoren zu entwickeln, die sequenzspezifisch an DNA binden. Zur Entwicklung therapeutisch einsetzbarer, künstlicher Transkriptionsfaktoren muss zunächst einmal eine Möglichkeit gefunden werden, Sequenzen auf der DNA spezifisch zu erkennen und daran zu binden. Um dies zu erreichen, müssen die DNA-bindenden Epitope in den DNA-bindenden Peptiden oder Proteinen bestimmt werden. Anschließend können in diesen Epitopen die Wechselwirkungen der Transkriptionsfaktoren mit der DNA auf der Ebene der beteiligten Aminosäuren und Nukleotide untersucht werden. Die erhaltenen Ergebnisse könnten zur Aufstellung von Regeln führen, die es ermöglichen würden, sequenzspezifisch an DNA bindende Peptide zu synthetisieren. Zu diesem Zweck können Peptide mit der Aminosäuresequenz der an der DNA-Bindung beteiligten Bereiche eingesetzt werden. Dies hat den Vorteil, dass die Peptide relativ einfach synthetisiert und chemisch werden können. In dieser Arbeit wird die Synthese DNA-bindender Peptide als Komponenten verschiedener Systeme und deren Charakterisierung sowie die Untersuchung ihrer Interaktion mit DNA vorgestellt. Durch epitope mapping soll das DNA-bindende Epitop des Transkriptionsaktivators ExpG aus S. meliloti gefunden werden. Es werden kurze Peptide mit Abschnitten aus der Primärstruktur des Proteins synthetisiert und ihre Wechselwirkungen mit der entsprechenden DNA untersucht. Hierdurch sollte es möglich sein, das DNA-bindende Epitop aufzufinden. Dieser bottom-up Ansatz zur Aufklärung von DNA/Protein-Wechselwirkungen könnte allgemein angewendet werden und die Untersuchungen von Regulationssystemen der Proteinexpression vereinfachen. Die Auswirkungen verschiedener Mutationen auf die Bindungseigenschaften eines Peptids mit der Aminosäuresequenz eines DNA-bindenden Epitopes aus einem Transkriptionsaktivator werden beschrieben. Als Modellsystem dient PhoB aus E. coli, das die Expression von nahezu 40 Genen unter Phosphatmangelbedingungen kontrolliert. Aus NMR- und Röntgenstrukturanalyse sowie Mutationsexperimenten ist bekannt, über welche Aminosäurereste es an die DNA bindet. Durch den Austausch der an der Bindung beteiligten Aminosäurereste sollen deren Beiträge zur Bindung untersucht und die Bindung durch Mutation nicht an der Bindung beteiligter Reste verbessert werden. Weiterhin soll die Synthese eines photoschaltbaren, DNA-bindenden Peptides durchgeführt werden, das auf dem Bisinterkalator TANDEM beruht. Anhand dieser beiden Systeme soll das Grundverständnis für die Vorgänge bei der spezifischen Bindung von Peptiden an DNA erhöht werden. Langfristig können diese Erkenntnisse zur Entwicklung von Substanzen und letztlich sogar Medikamenten beitragen, die direkt in die Expression von Genen eingreifen. Der Schwerpunkt der Arbeit liegt in der Synthese der Peptide und der Untersuchung ihrer Wechselwirkungen mit DNA im Molekülensemble. Weiterhin werden die mittels Oberflächenplasmonresonanz und CD-Spektroskopie im Molekülensemble erhaltenen Daten mit Einzelmoleküldaten aus der Atomkraftspektroskopie verglichen.