PUB - Publikationen an der Universität Bielefeld

Im Laufe dieser Arbeit wurde die Charakterisierung der LCL-Proteine aus A. thaliana durchgeführt. Diese wurden, zusammen mit den Clock-Proteinen CCA1 und LHY, die wichtige Komponenten des zentralen Oszillators darstellen, und den vier EPR1-like Proteinen, in die LHY MYB Proteinfamilie eingeordnet. Das gemeinsame Kennzeichen der LHY MYB Proteine ist ihre LHY MYB family Domäne, die die MYB-Domäne enthält. Diese ist verantwortlich für die spezifische DNA-Bindung. Von LHY und CCA1 weiß man, dass sie damit an ein Promotorelement namens evening element binden, welches sich in Promotoren circadian regulierter Gene befindet. In dem Bereich, der sich C-Terminal an die MYB-Domäne anschließt, befindet sich die NLS, deren Sequenz in allen elf Proteinen identisch ist. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass alle LCL-Proteine, wie auch EPR1, die Fähigkeit besitzen, an das gleiche Promotorelement wie LHY und CCA1 zu binden. Dies wurde einerseits in vitro durch EMSA-Analysen festgestellt und konnte andererseits in vivo durch eine Hefe One-Hybrid Analyse bestätigt werden. Dabei konkurrieren LCL1 und CCA1 um die EE-Bindestelle. Es konnte gezeigt werden, dass es sich bei LCL1, LCL2, LCL4 und LCL5 um nucleocytoplasmatische Shuttle-Proteine handelt, die sowohl eine NLS als auch eine NES besitzen. Das Vorhandensein eines Kernexportsignals in einem Transkriptionsfaktor lässt vermuten, dass seine Regulation über nucleocytoplasmatische Partitionierung gesteuert wird. Denn nur wenn ein Transkriptionsfaktor im Kern zur Verfügung steht, kann er seine Funktion als Transkriptionsaktivator oder -repressor ausüben. Charakteristisch für die LCL-Proteine ist ein nahezu identischer Sequenzbereich am C-terminalen Ende der Proteine, den wir LCL-Domäne genannt haben und der in LCL1, LCL2, LCL4 und LCL5 die NES enthält. Die Proteine der LHY MYB Familie üben ihre Funktionen vermutlich als Dimere aus. Die Proteindimerisierungsdomäne liegt zwischen der LHY MYB family Domäne und der LCL-Domäne. Durch Erkenntnisse aus Y2H-Versuchen und BiFC-Analysen wissen wir, dass das Dimerisierungspotential sehr ausgeprägt ist. Wir konnten zeigen, dass die beiden Clock-Proteine untereinander sowohl Homodimere als auch Heterodimere ausbilden können. Die LCL-Proteine liegen ebenfalls als Dimere in der Pflanzenzelle vor. Hierbei können potenziell folgende Proteine dimerisieren: LCL1-LCL1, LCL1-LCL2, LCL1-LCL4, LCL1-LCL5, LCL2-LCL4, LCL2-LCL5, LCL4-LCL4, LCL4-LCL5 und LCL5-LCL5. Interessanterweise ist die Verteilung der Dimere zwischen Kern und Cytoplasma sehr unterschiedlich. Untersuchungen mit GFP-Fusionsproteinen und BiFC-Analysen verdeutlichen, dass die Clock-Proteine als Monomere und als Dimere ausschließlich im Kern vorhanden sind, wohingegen die LCL-Dimere unterschiedliche Verteilungsmuster aufweisen. Hierbei konnten spezifische Veränderungen in der Lokalisation der LCL-Proteine in Abhängigkeit zum Interaktionspartner aufgezeigt werden. Dies lässt auf eine weitere Regulation dieser Proteine durch nucleocytoplasmatische Lokalisation schließen. Wie für einen Transkriptionsfaktor erwartet wird, der möglicherweise eine Rolle im zentralen Oszillator einnimmt, konnte durch Promotor-GUS Analysen gezeigt werden, dass der LCL1-Promotor in allen untersuchten Geweben und Entwicklungsstadien aktiv ist. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass LCL1, wie die beiden Clock-Proteine, eine circadiane Expression mit einer maximalen mRNA-Menge am Morgen aufweist. Den LCL-Proteinen kann möglicherweise eine modulierende Rolle im zentralen Oszillator der circadianen Uhr von A. thaliana zugesprochen werden, da sie die gleiche DNA-Zielsequenz erkennen wie die Clock-Proteine. Es liegen Hinweise vor, dass sie, genauso wie LHY und CCA1, Transkriptionsrepressoren von Genen darstellen, deren Promotor das EE enthält. Analysen mit transgenen Pflanzen lassen außerdem vermuten, dass LHY LCL1 positiv beeinflusst und dass LCL1 seine eigene Expression hemmt. Somit wäre denkbar, dass LCL1 eine Funktion als slave oscillator einnehmen könnte.