PUB - Publikationen an der Universität Bielefeld

During activation of B cells after cross-linking of the B cell receptor phospholipase C g2 (PLCg2) is activated leading to depletion of inositol 1,4,5-trisphosphate sensitive intracellular stores. Following this, Ca2+ channels in the plasmamembrane are opened, which results in a prolonged rise in the cytosolic free Ca2+ concentration. After two decades of research the TRPC family contains the most probable proteins for the molecular identity of these channels, although the regulation of TRPC channels and their composition is still unclear. Subject of the study were the interaction possibilities of three isoforms expressed in murine A20 B-cells: TRPC1, TRPC2 and TRPC3, first with each other and second with further lymphocytic proteins. Furthermore, the role of the N-terminal ankyrin-like repeats and the coiled-coil domain should be deciphered. The results showed that TRPC1, TRPC2 and TRPC3 were able to form homo- as well as heterotetramers, in which the association was facilitated both via the fifth and sixth transmembrane segment including the pore region and via the N-terminus. For the latter the first N-terminal amino acids seemed to be essential. Both the ankyrin-like repeats and the coiled-coil domain possess a regulatory influence on the composition of the channels. In consequence TRPC1 prefers heterotypic interaction with TRPC3 to homotypic interactions. The N-terminal domains are not responsible for the association with the LAT (linker for activation of T-cells) localized in lipid rafts. TRPC1 is tightly bound via its N-Terminus to the actin cytoskeleton. This interaction is probably mediated by tropomodulin 3, the capping protein of the pointed (slowly growing) ends of actin-tropomyosin-filaments. Last but not least a screening of an A20 expression library using the yeast two-hybrid system gave new proof of the association of TRPC1 with several proteins that are connected with transport processes, which supports the model of the secretion-like activation.

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Im Rahmen der Aktivierung von B-Zellen nach Quervernetzung des B-Zellrezeptors kommt es zur Aktivierung der Phospholipase C g2 (PLCg2) und infolgedessen zur Entleerung der Inositol-1,4,5-trisphosphat-sensitiven intrazellulären Ca2+-Speicher. Anschließend werden Ca2+-Kanäle in der Plasmamembran geöffnet, was zu einem langanhaltenden Anstieg der cytosolischen Ca2+-Konzentration führt. Nach zwei Jahrzehnten der Forschung sind die Mitglieder der TRPC-Familie die wahrscheinlichsten Kandidaten für die molekulare Identität dieser Kanäle, allerdings ist weder die Regulation der TRPC-Kanäle noch ihre Zusammensetzung endgültig aufgeklärt. Im Rahmen dieser Arbeit sollte die Interaktionsfähigkeit der drei in Maus-A20-B-Zellen exprimierten Isoformen TRPC1, TRPC2 und TRPC3 untersucht werden, sowohl miteinander als auch mit anderen in Lymphocyten exprimierten Proteinen, und die Rolle der N-terminalen Ankyrin-ähnlichen Wiederholungen und der "coiled-coil"-Domäne entschlüsselt werden. Dabei zeigte sich, dass TRPC1, 2 und 3 zur Bildung von Homo- wie auch Heterotetrameren in der Lage waren, wobei die Bindung sowohl über das 5. bis 6. Transmembransegment inklusive der Porenregion als auch über den N-Terminus vermittelt wird. Dabei scheinen die N-terminalen Aminosäurereste entscheidend zu sein. Sowohl die Ankyrin-ähnlichen Wiederholungen als auch die "coiled-coil"-Domäne besitzen eine gewisse steuernde Wirkung auf die Zusammensetzung der Kanäle, wobei TRPC1 heterotypische Wechselwirkungen mit TRPC3 gegenüber homotypischen Wechselwirkungen bevorzugt. Für die Bindung an das in Lipid Rafts lokalisierte LAT ("linker for activation of T-cells") sind die N-terminalen Domänen nicht zuständig. TRPC1 ist jedoch über seinen N-Terminus fest an das Actincytoskelett gebunden. Höchstwahrscheinlich wird diese Bindung durch Tropomodulin 3, das kappende Protein der langsam wachsenden Enden von Actin-Tropomyosin-Filamenten vermittelt. Darüber hinaus ergab die Durchmusterung einer A20-Expressionsgenbank mit Hilfe des "Yeast Two Hybrid" Systems Hinweise auf die Anbindung von TRPC1 an weitere Proteine, die mit Transportprozessen in Verbindung stehen, was das Modell der sekretionsähnlichen Aktivierung unterstützt.