PUB - Publikationen an der Universität Bielefeld

Mikroskope ermöglichen Einblicke in dem Menschen ohne Hilfsmittel verborgene Bereiche. Gerade diese kleinen Strukturen faszinieren die Menschen jedoch schon seit Jahrtausenden. Der wahre Siegeszug der Lichtmikroskopie seit ihrer Entstehung zu Beginn des 17. Jahrhunderts, der bis heute vorangetrieben wird durch die Entwicklung immer neuer, höher auflösender Techniken, kann mit dem menschlichen Bedürfnis nach visueller Bestätigung erklärt werden. Das Lichtmikroskop erzeugt ein Bild des beobachteten Gegenstands, das das menschliche Auge so abbildet wie einen realen Gegenstand. Dadurch entsteht beim Betrachter das Gefühl von Begreifen. Prinzipiell werden mit einem Lichtmikroskop Strukturen aufgelöst, die nicht kleiner als etwa 200 nm sind. In der konfokalen Fluoreszenzmikroskopie werden fluoreszierende Sonden eingesetzt, um Strukturen auflösen zu können. Die Auflösung wird dadurch erhöht, dass durch eine Lochblende im Strahlengang nur Licht aus dem Fokus zum Detektor gelangt. Mit der konfokalen Fluoreszenzmikroskopie können einzelne, fluoreszierende Moleküle in Lösung bis zu picomolaren Konzentrationen nachgewiesen werden. Zur weiteren Erhöhung der Auflösung wurden unterschiedliche Methoden entwickelt, die Abbildungen unterhalb der Beugungsgrenze ermöglichen. Dazu zählen sowohl die STED-Mikroskopie (engl. stimulated emission depletion) als auch STORM (engl. stochastic optical reconstruction microscopy). Im Gegensatz zu diesen Techniken zählt der Förster Resonanz-Energietransfer (FRET) nicht zu den bildgebenden Verfahren. FRET beruht auf einer strahlungslosen Dipol-Dipol-Wechselwirkung, durch die die Energie eines elektronisch angeregten Donorfarbstoffs auf einen spektral passenden Akzeptorfarbstoff übertragen wird, und kann genutzt werden, um Abstände im Bereich von 2 nm bis 10 nm zu bestimmen. Aufgrund der Abhängigkeit der FRET-Effizienz von der inversen sechsten Potenz des Abstands können aus den FRET-Effizienzen die Abstände der Fluorophore mit hoher Sensitivität berechnet werden. So wird FRET vielfach zur Abstandsmessung in biologisch relevanten Molekülen eingesetzt. Viele Informationen über die Funktion von Biomolekülen können bereits aus relativen Abstandsmessungen gewonnen werden. Dennoch ist die Bestimmung von exakten Abständen im Bereich einiger Nanometer mittels FRET wünschenswert. Die Grundlage für exakte Abstandsmessungen auf Nanometerskalen sind stäbchenförmige Moleküle, die an beiden Enden geeignete Fluorophore tragen. Die Starrheit der Moleküle ist dabei, ebenso wie die definierte Ausrichtung der Dipolmomente der Fluorophore, entscheidend für die Präzision der Abstandsbestimmung. Zur Validierung der von Stryer und Haugland (1967) als "spektroskopisches Lineal" (engl. spectroscopic ruler) bezeichneten Technik werden molekulare Lineale benötigt. In dieser Arbeit soll FRET durch Ensemble- und Einzelmolekülmessungen vollständig charakterisiert werden. Dazu werden FRET-Messungen an Oligo- und Polyprolinen und an formtreuen Oligo(paraphenylenethinylen) (OligoPPE) Molekülen verglichen. OligoPPE sind extrem starre, organische Stäbchenmoleküle, bei denen eine definierte Orientierung der Übergangsdipolmomente der endständig gekoppelten Fluorophore erreicht werden kann. Durch einen Vergleich der FRET-Effizienz, bestimmt aus Fluoreszenzspektroskopie, zeitaufgelöster Fluoreszenzspektroskopie und Einzelmolekülfluoreszenzspektroskopie mit alternierender Anregung (ALEX), werden die Grenzen der Zuverlässigkeit von FRET-Messungen ausgelotet und Konkurrenzprozesse, wie fluoreszenzlöschende Dimerbildung, identifiziert. Zudem wird der Einfluss der Orientierung der Übergangsdipolmomente auf FRET aufgezeigt.