PUB - Publikationen an der Universität Bielefeld

Proteinkinasen spielen hinsichtlich eukaryotischer intrazellulärer Kommunikation, Regulation und Signaltransduktion eine zentrale Rolle. Fehlfunktionen der Mitglieder dieser Enzymfamilie führen oftmals zu unkontrolliertem Zellwachstum (Bishop, 1987; Pawson and Hunter, 1994). Die Proteinkinase A (PKA) dient als Modell für die gesamte Enzymfamilie. Ziel dieser Arbeit war es, Hinweise auf die Funktion der konservierten Aminosäurereste Phenylalanin 185 und Glutamat 91 der katalytischen Untereinheit C[alpha] von PKA zu erhalten. Dazu wurden Methoden etabliert und entwickelt, die eine kinetische und strukturelle Charakterisierung entsprechender Mutanten ermöglichten. Der Rest Phenylalanin 185 ist Bestandteil des hochkonservierten DFG-Motivs, welches den Anfang des Aktivierungssegmentes von Proteinkinasen markiert. Die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Untersuchungen lassen den Schluss zu, dass die hohe Konserviertheit des Phenylalaninrestes möglicherweise nicht allein durch eine essentielle Funktion bei der Katalyse bedingt ist. Darüber hinaus geben sie Hinweise für eine hohe Konformationsflexibilität im Bereich von F185. Strukturen der inaktiven cytoplasmatischen Proteinkinase-Domäne des Insulinrezeptors (IRK) (Hubbard et al., 1994), der inaktiven katalytischen Domäne der Abelson Tyrosinkinase (Abl) (Schindler et al., 2000) sowie der MAP-Kinase p38 (persönliche Mitteilung Dr. D. Bossemeyer) zeigen Positionsveränderungen des entsprechenden Phenylalaninrestes, die anscheinend essentiellen Anteil an der Inaktivität haben und konformelle Flexibilität erfordern. Vor diesem Hintergrund unterstützen die durch diese Arbeit gewonnenen Erkenntnisse die Möglichkeit, dass der Phenylalaninrest des DFG-Motivs eine generelle regulatorische Funktion bei Proteinkinasen übernimmt. Der invariante Aminosäurerest Glutamat 91 ist in der Mitte der Helix C lokalisiert und interagiert mit dem ebenfalls invarianten und für die Nukleotidbindung essentiellen Rest Lysin 72. Strukturen inaktiver Proteinkinasen zeigen oftmals eine positionelle oder konformelle Beeinträchtigung der Helix C, die in vielen Fällen mit einem Verlust der Salzbrücke zwischen E91 und K72 bzw. den entsprechenden homologen Resten einhergeht (Engh and Bossemeyer, 2001). Die Untersuchungen dieser Arbeit zeigen, dass der Verlust der genannten Interaktion zwar keine Dislokation der Helix C, jedoch eine drastisch eingeschränkte Aktivität bewirkt. Darüber hinaus ergeben sich Hinweise auf den molekularen Mechanismus, durch den die Aktivität beeinflusst wird. Die Erkenntnisse legen damit nahe, dass dem invarianten Glutamatrest eine essentielle Rolle bei einem generell bei Proteinkinasen verwirklichten strukturellen Regulationsmechanismus zukommt. Die Resultate insgesamt liefern Ansatzpunkte für die Entwicklung neuer therapeutisch wirksamer Inhibitoren.