PUB - Publikationen an der Universität Bielefeld

Das glnB-Gen, das ein Signaltransduktionsprotein P II kodiert, wurde in dem in einer endophytischen Assoziation in Zuckerrohr lebenden diazotrophen Bakterium Acetobacter diazotrophicus über PCR mit degenerierten glnB-Primern, die von bekannten glnB-Nukleotidsequenzen abgeleitet wurden, identifiziert. Die erhaltenen PCR-Produkte wurden kloniert und über Sequenzierung charakterisiert. Interessanterweise zeigte die Sequenzierung, dass zwei verschiedene gleich große zu dem glnB-Gen homologe Amplifikate unterschiedlicher Sequenz auftreten, die auf DNA- bzw. Proteinebene zu 70 v.H. bzw. 64 v.H. identisch sind. Eine Phagen-Genbank von A. diazotrophicus Gesamt-DNA wurde konstruiert und mit den klonierten PCR-Amplifikaten als Sonden gescreent. Die Sequenzanalyse zeigte, dass das glnB-Gen mit dem glnA und das glnB-Homolog glnK1 mit dem amtB1-Gen geclustert vorliegt. Diese Genanordnung ist charakteristisch für die Proteobakterien [alpha]-Gruppe, zu der auch A. diazotrophicus gehört. Durch Southern Hybridisierung der Gesamt-DNA von A. diazotrophicus gegen ein glnK1amtB1-Fragment als Sonde wurde ein drittes glnB-homologes Gen, glnK2, das wie das glnK1-Gen benachbart zu einem amtB-homologen Gen liegt, isoliert. Damit ist A. diazotrophicus das erste Mitglied der [alpha]-Gruppe der Proteobakterien, in dem drei Kopien des glnB-homologen Gens beschrieben sind. Restriktionsfragmente, die die vollständigen Regionen der glnB-Homologen und diesen Genen benachbarten ORFs tragen, wurden aus der Phagen-Genbank isoliert und sequenziert. Insgesamt wurden drei Fragmente - glnBglnA (4 kb, auf dem Plasmid pOP26), glnK1amtB1 (2,5 kb, auf dem Plasmid pOP7) und glnK2amtB2 (3,2 kb, auf dem Plasmid pOP80) - sequenziert. Alle drei glnB-homologen Gene kodieren 112 AS lange Regulatorproteine, die in unterschiedliche Regulationskaskaden des Energie- und Stickstoff-Metabolismus und auch der Stickstofffixierung involviert sein können. Das abgeleitete Genprodukt des glnA-Gens zeigt hohe Übereinstimmungen mit den Glutamin-Synthetasen anderer Organismen. Die Gene amtB1 und amtB2 kodieren für Transportproteine der Amt/Mep-Familie (Ammoniumtransporter). Durch eine Interposonmutagenese konnten glnB-, glnK1-, amtB1-Mutanten und glnBglnK1-Doppelmutanten erzeugt werden, welche die physiologische Rolle der entsprechenden Genprodukte in A. diazotrophicus klären sollten. Inaktivierung des glnA-Gens scheint letal zu sein und das Gen könnte essentiell in diesem Organismus sein. Alle Mutanten sind weiterhin in der Lage, Luftstickstoff zu fixieren. Die Acetylen-Reduktions-Messung zeigte aber die Nitrogenase-Aktivität in Gegenwart von 20 mM NH4+ in glnB- und glnBglnK1-Mutanten. Das PII-Protein (glnB-Genprodukt) könnte also in die Regulation der Expression der nif-Gene wahrscheinlich über die Kontrolle der Expression oder Aktivität des Transkriptionsaktivators der nif-Gene (das NifA-Protein) involviert sein. Die glnK1-Mutante zeigt keine phänotypischen Unterschiede zum Wildtyp Pal5 in Bezug auf die N2-Fixierung. Eine in vitro Uridylylierung der PII-Proteine mit radioaktiv-markierten [[alpha]32P]-UTP zeigte ein Signal in glnBglnK1-Doppelmutanten und bestätigte damit, dass mindestens GlnK2-Protein, das in diesen Mutanten vorhanden ist, in A. diazotrophicus durch Uridylylierung an einem Tyrosinrest-51 modifiziert wird. Die Messung der Aufnahme des radioaktiv-markierten Ammonium-Analogons [14C]-Methylammonium zeigte, dass die Aufnahme der radioaktiven Substanz in der amtB1-Mutante im Vergleich zum Wildtyp zwar reduziert ist, dass das AmtB1 aber nicht das einzige Protein ist, das Methylammonium transportiert. Das daraufhin isolierte amtB2-Gen, dessen abgeleitetes Genprodukt den Ammoniumtransportern ähnlich ist, könnte also ebenfalls einen Methylammoniumtransporter kodieren, der mit amtB1 zusammenwirkt.