ColE1-Plasmidproduktion in Escherichia coli: Simulation und Experiment

Freudenau I (2014)
Bielefeld: Universitätsbibliothek.

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Bielefeld Dissertation | German
Abstract
Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein mathematisches Modell zur Simulation der ColE1-Plasmidreplikationskontrolle für den low copy plasmidtragenden Stamm DH5α−pSUP 201-3 und für den high copy plasmidtragenden Stamm DH5α-pCMV-lacZ unter Verwendung von MATLAB, Mathworks©erstellt. Das Modell beinhaltet die Plasmidreplikationskontrolle durch die regulatorischen RNA-Moleküle, RNAI und RNAII sowie die Regulation durch unbeladene tRNA-Moleküle. Zur Untermauerung des Modells wurden experimentelle Daten, wie die RNAI- und RNAII-Konzentration, die Plasmidkopienzahl sowie die Wachstumsrate für jeweils drei verschiedene Zeitpunkte bestimmt. Die für DH5α-pSUP 201-3 durchschnittlich gemessenen RNA-Konzentrationen betragen, abhängig vom Messzeitpunkt, 6±0.7 bis 34±7 RNAI-Moleküle pro Zelle und 0.44±0.1 bis 3±0.9 RNAII-Moleküle pro Zelle. Die durchschnittlich gemessenen Plasmidkopienzahlen von pSUP 201-3 betragen 46±26 bis 48±30. Die für DH5α-pCMV-lacZ durchschnittlich gemessenen Plasmidkopienzahlen liegen mit 1514±1301 bis 5806±4828 Plasmiden pro Zelle deutlich höher. Ebenso verhält es sich mit den gemessenen RNAI- und RNAII-Konzentrationen. Die durchschnittlich ermittelte Anzahl an RNAI-Molekülen pro Zelle für DH5α-pCMV-lacZ bewegt sich zwischen 345±203 und 1086±298. Die durchschnittlich gemessene RNAII-Konzentration beträgt 22±2 bis 75±10 Moleküle pro Zelle. Die experimentellen Daten dienen als Anfangsbedingungen für das Modell, wenn die ColE1-Plasmidreplikationskontrolle für eine einzelne Zelle simuliert wird und die Simulationen an einem der drei entsprechenden Messzeitpunkte beginnen. Mit Hilfe des Modells wurde untersucht, welchen Effekt es auf die Plasmidproduktion hätte, würde man tRNA-Moleküle derart modifizieren, dass die Beladung mit einer Aminosäure durch die Aminoacyl-tRNA-Synthetase nicht mehr möglich wäre. Die Simulationen zur Untersuchung dieser Fragestellung haben gezeigt, dass solche modifizierten tRNA-Moleküle die Plasmidproduktion in silico erhöhen. Um diese in silico-Vorhersagen im Labor zu überprüfen, wurde das leuQ-Gen dahingehend verändert, dass das kodierte Genprodukt eine Leucin-tRNA darstellt, die von der Leucyl-tRNA-Synthetase nicht mehr erkannt wird und somit unbeladen bleibt. Das modifizierte leuQ-Gen wurde mittels Transposon-Mutagenese in das Chromosom von E. coli DH5α inseriert. Erste Versuche bestätigten die in silico-Vorhersagen und zeigten eine leichte Erhöhung der in trazellulären Plasmidkonzentration. Neben der Regulation der Plasmidreplikation auf Genomebene lässt sich die Plasmidreplikation auf Metabolomebene durch die Verfügbarkeit von Nukleotiden kontrollieren. Inwieweit die Plasmidproduktion durch den Metabolismus der Zelle limitiert ist, wurde bisher wenig untersucht. Aus diesem Grund wurde in dieser Arbeit die Regulation auf Metabolomebene durch Metabolitprofilanalysen und13C-Flussmessungen untersucht. Im Rahmen dieser Analysen sollte der Frage nachgegangen werden, welchen Einfluss der Plasmidgehalt einer Zelle auf ihre Metabolitzusammensetzung hat. Dabei wurden der plasmidfreie Stamm DH5α sowie die Stämme DH5α-pSUP 201-3 und DH5α-pCMV-GFP untersucht. Anhand einer Hauptkomponentenanalyse konnte gezeigt werden, dass sich die drei Stämme hinsichtlich ihrer Metabolitprofile deutlich voneinander unterscheiden. Untersucht man die Konzentrationen von Ribose, Ribose-5-phosphat und Xylose sieht man Unterschiede in den Metabolitpools, die mit dem unterschiedlichen Plasmidgehalt begründet werden können, da diese Metabolite von allen identifizierten Metaboliten über den Pentosephosphatweg am direktesten mit der Nukleotidbiosynthese in Verbindung stehen. Die Ergebnisse der13C-Flussmessungen deuten darauf hin, dass der Glukosefluss in den Pentosephosphatweg bei den untersuchten Plasmidproduktionsstämmen W3110-pHN, VH33-pHN, VH33∆ recA-pHN, VH33∆ (recA deoR)-pHN vom Plasmidgehalt der Zelle abhängt, so dass bei Zellen mit einer höheren Plasmidproduktion ein größerer Anteil der aufgenommenen Glukose in den Pentosephosphatweg fließt und dort zur Synthese von Vorstufen für die Nukleotidbiosynthese zur Verfügung steht.
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Freudenau I. ColE1-Plasmidproduktion in Escherichia coli: Simulation und Experiment. Bielefeld: Universitätsbibliothek; 2014.
Freudenau, I. (2014). ColE1-Plasmidproduktion in Escherichia coli: Simulation und Experiment. Bielefeld: Universitätsbibliothek.
Freudenau, I. (2014). ColE1-Plasmidproduktion in Escherichia coli: Simulation und Experiment. Bielefeld: Universitätsbibliothek.
Freudenau, I., 2014. ColE1-Plasmidproduktion in Escherichia coli: Simulation und Experiment, Bielefeld: Universitätsbibliothek.
I. Freudenau, ColE1-Plasmidproduktion in Escherichia coli: Simulation und Experiment, Bielefeld: Universitätsbibliothek, 2014.
Freudenau, I.: ColE1-Plasmidproduktion in Escherichia coli: Simulation und Experiment. Universitätsbibliothek, Bielefeld (2014).
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Übersicht zu den detektierten Metaboliten
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