Analyse von Regulationsnetzwerken der Extracytoplasmic Function (ECF)-Sigmafaktoren in Corynebacterium glutamicum

Busche T (2013)
Bielefeld: Universitätsbibliothek Bielefeld.

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Bielefeld Dissertation | German
Abstract
Die Anpassung an sich ändernde Umwelteinflüsse ist eine wesentliche Voraussetzung für das Leben allgemein, und im speziellen für das Überleben von Bakterien. Dies geschieht unter anderem über die Regulation der Genexpression. Der erste Schritt der Genexpression, die Transkiptionsinitiation, ist der am häufigsten und am stärksten regulierte Schritt in Bakterien. Hierfür verwenden Bakterien unter anderem verschieden Sigmafaktoren. Sigmafaktoren sind Untereinheiten der bakteriellen RNA-Polymerase und sorgen zusammen mit dem RNA-Polymerase Core-Enzym als Holo-Enzyme für die Erkennung spezifischer Promotorsequenzen. Sie kontrollieren oft große Netzwerke von Genen. Gerade die ECFSigmafaktoren sind in Bakterien weit verbreitet und erfüllen wichtige Funktionen in der Stressantwort. Der Gram-positive Modellorganismus Corynebacterium glutamicum besitzt sieben Sigmafaktoren, darunter den Housekeeping Sigmafaktor SigA, den alternativen SigAähnlichen Sigmafaktor SigB und fünf ECF (Extracytoplasmic Function)-Sigmafaktoren (SigC, SigD, SigE, SigH und SigM). Im Rahmen dieser Arbeit wurden die ECF-Sigmafaktoren SigH und SigE und deren Anti-Sigmafaktoren RshA bzw. CseE näher untersucht. Für SigH war bekannt, dass es in C. glutamicum und in anderen Actinomyzeten die Antwort auf Hitze- und oxidativen Stress reguliert. Für SigE war eine Beteiligung an der Antwort auf Oberflächen-Stress vermutet worden. Durch die in vivo Transkriptomanalyse von Sigmafaktor- und Antsigmafaktorgen-Mutanten mittels Microrarray-Analyse und RNA-Sequenzierung in Kombination mit der Analyse spezifischer Sigmafaktor-RNAP-Komplexe in vitro durch ROSE (Run-Off Transcription/RNASequencing)konnten die ECF-Sigmafaktor-Netzwerke von SigH und SigE und ihre Interaktionen, die Funktion der Anti-Sigmafaktoren und die transkriptionelle Organisation der beiden Sigmafaktor/Anti-Sigmafaktor Operons erstmalig und detailliert beschrieben werden. Die ROSE-Methodik stellt dabei eine im Rahmen dieser Arbeit erfolgte Neuentwicklung zur genomweiten in-vitro Transkription mit Einzelnukleotidauflösung dar. Das SigH-Regulon war bereits durch frühere Arbeiten untersucht worden, konnte aber um Gene der SOS-Antwort (uvrA, uvrC und uvrD3), der Proteinqualitätskontrolle (pup und diverse Proteasen) und einer Reihe von Genen, die Membranproteine kodieren, erweitert werden. Daneben wurde das Spektrum der Proteine des SigH-Regulons erweitert, die der Aufrechterhaltung der Redox-Homöostase dienen. Es konnte weiter gezeigt werden, dass RshA in C. glutamicum die Aufgabe als Anti-Sigmafaktor besitzt und das das rshA-Gen SigHabhängig transkribiert wird. Durch diese Arbeit konnte das SigE-Regulon erstmalig umfassend beschrieben werden. Bei den Genfunktionen des SigE-Netzwerks handelt es sich hauptsächlich um Membranproteine,was im Einklang mit dem Einfluß des SigE-Netzwerkes auf die Antwort von Membran-Stress steht. Daneben konnte interessanterweise das Gen für den globalen Regulator des Stickstoffmetabolismus AmtR als Mitglied des SigE-Netzwerkes identifiziert werden. Es konnte weiter gezeigt werden, dass der Großteil des SigE-Regulons bis auf AmtR ebenfalls Bestandteil des SigH-Regulon ist. Das sigE-Gen liegt, wie sigH-rshA, in einem Operon mit dem Gen für den Anti-Sigmafaktor, rseA. Auch hier wird das Anti-Sigmafaktorgen in Abhängigkeit des entsprechenden Sigmafaktors transkribiert. Der rseA-Promotor wird allerdings zusätzlich von SigH erkannt. Es konnte, wie für Mycobacterium tuberculosis beschrieben, gezeigt werden, dass die ECFSigmafaktoren SigH und SigE in C. glutamicum ähnliche Promotoren erkennen. Dabei ist der 3`-Bereich des -35 Promotormotivs für die Unterscheidung von SigH und zusätzlich SigEabhängigen Promotoren verantwortlich. Somit konnte klar gestellt werden, dass die Regulationsnetzwerke von SigH und SigE auf verschiedenen Ebenen hierarchisch verflochten sind. Während das SigH-Netzwerk vermutlich der Bekämpfung der unter vielen Stressbedingungen auftretenden Auslenkung der Redox- Homöostase dient, integriert das partiell untergeordnete SigE-Netzwerk vermutlich die spezielle Reaktion auf Oberflächenstress und ein Herunterfahren des Stickstoffmetabolismus unter den spezifischen Induktionsbedingungen für SigE. Da Oberflächenstress sicher auch ohne masive Störung der Redox-Homöostase vorkommen kann, erlaubt die Verknüpfung der Netzwerke so eine flexiblere Antwort. Zusammenfassend konnten die erzielten Ergebnisse dazu genutzt werden das Sigmafaktor-Netzwerk in C. glutamicum näher zu charakterisieren. Es zeigen sich bei der Verknüpfung viele Parallelen zu orthologen Sigmafaktoren in den verwandten Actinobakterien M. tuberculosis und Streptomyces coelicolor. Die entwickelten komplementären in vivo und in vitro-Methoden haben ein großes Potential für zukünftige Studien von bakteriellen Regulationsnetzwerken.
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Busche T. Analyse von Regulationsnetzwerken der Extracytoplasmic Function (ECF)-Sigmafaktoren in Corynebacterium glutamicum. Bielefeld: Universitätsbibliothek Bielefeld; 2013.
Busche, T. (2013). Analyse von Regulationsnetzwerken der Extracytoplasmic Function (ECF)-Sigmafaktoren in Corynebacterium glutamicum. Bielefeld: Universitätsbibliothek Bielefeld.
Busche, T. (2013). Analyse von Regulationsnetzwerken der Extracytoplasmic Function (ECF)-Sigmafaktoren in Corynebacterium glutamicum. Bielefeld: Universitätsbibliothek Bielefeld.
Busche, T., 2013. Analyse von Regulationsnetzwerken der Extracytoplasmic Function (ECF)-Sigmafaktoren in Corynebacterium glutamicum, Bielefeld: Universitätsbibliothek Bielefeld.
T. Busche, Analyse von Regulationsnetzwerken der Extracytoplasmic Function (ECF)-Sigmafaktoren in Corynebacterium glutamicum, Bielefeld: Universitätsbibliothek Bielefeld, 2013.
Busche, T.: Analyse von Regulationsnetzwerken der Extracytoplasmic Function (ECF)-Sigmafaktoren in Corynebacterium glutamicum. Universitätsbibliothek Bielefeld, Bielefeld (2013).
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