Identifizierung und funktionelle Analyse der humanen Xylosyltransferase I- und II-Promotoren

Müller B (2009)
Bielefeld (Germany): Bielefeld University.

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Bielefeld Dissertation | German
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The xylosyltransferases I and II (XT-I and XT-II) catalyze the transfer of xylose from UDP-xylose to selected serine residues in the proteoglycan core protein, which is the initial and rate-limiting step in glycosaminoglycan biosynthesis. Both XT isoforms represent key enzymes in extracellular matrix assembly and remodeling and do also play a major role in various pathological processes. The xylosyltransferases show a high degree of homology in structure and function. Nevertheless, they have divergent expression levels in different cell types and tissues as well as during the osteogenic and chondrogenic mesenchymal stem cell differentiation. Furthermore, a different response to growth factors of the TGF[beta] family has been observed. The mechanisms underlying the transcriptional regulation of both XYLT genes have not been characterized yet. In my thesis, I identified for the first time the promoter regions of XT-I and XT-II as well as important transcription factors involved in their regulation. Both putative regulatory regions lack typical promoter elements like a TATA or CAAT box. In contrast, several GC boxes within a CpG island immediately upstream of the translation initiation sites were observed in both genes. To determine the minimal active promoter regions, different 5'- and 3'-truncated promoter fragments were generated by gene synthesis and PCR and subsequently inserted into a reporter gene vector system. A detailed activity analysis of each promoter reporter gene construct in the chondrosarcoma cell line SW1353 and in the hepatoma cell line HepG2 revealed that a 797 bp fragment is essential for full XYLT1 promoter activity. In contrast, a region encompassing 177 nucleotides immediately upstream of the translation start site was sufficient to drive the constitutive transcription of the XYLT2 gene in full strength. Using an in silico approach numerous putative transcription factor binding sites for transcription factors of the AP-1 and Sp1 protein family were identified. Several site-directed mutagenesis experiments as well as electrophoretic mobility shift and supershift assays using specific antibodies were used to clearly identify the transcription factors involved. The findings of my thesis were that cJun/AP-1 and Sp1 proteins essentially participate in the regulation of the XYLT1 gene. This was confirmed by using specific antibodies and sequence specific siRNA targeting Sp1 and Sp3. Additionally, a crucial role of Sp1 transcription factors in regulating the XYLT2 gene could be ascertained. A cooperative interaction of multiple Sp1 recognition sequences was determined as being necessary for the constitutive expression as well as for the vernier adjustment of the transcriptional regulation. The participation of the transcription factors identified for the activation of the XYLT genes was further verified using inhibitors against AP-1 and Sp1. Moreover, an alignment of the human and murine XYLT promoter regions revealed phylogenetically conserved AP-1 and Sp1 transcription factor binding sites. In conclusion, I demonstrated significant differences in the transcriptional regulation of both XT isoforms. These results can be used as a starting point for further investigation regarding the divergent cell type and tissue specific expression patterns of both xylosyltransferases. Furthermore, the findings of my thesis may contribute to elucidate the different physiological functions of both enzymes.

Die Xylosyltransferasen I und II (XT-I und XT-II) katalysieren den initialen Schritt in der posttranslationalen Biosynthese von Glykosaminoglykanketten durch den Transfer von UDP-aktivierter Xylose auf spezifische Serin-Reste von Proteoglykan-Core-Proteinen. Sie sind somit entscheidend an der de novo-Synthese und Umstrukturierung der extrazellulären Matrix sowie an zahlreichen pathophysiologischen Prozessen beteiligt. Beide XTs sind funktionell und strukturell sehr homolog, zeigen jedoch zell- und gewebespezifisch sowie während der mesenchymalen Stammzelldifferenzierung ein divergentes Expressionsmuster. Ferner konnte eine differente Induktion durch Wachstumsfaktoren der TGF[beta]-Familie beobachtet werden. Die zugrunde liegenden transkriptionellen Regulationsmechanismen sind bislang unbekannt. Im Rahmen dieser Arbeit erfolgte erstmals die Identifizierung der XT-I- und XT-II-Promotoren sowie eine detaillierte Charakterisierung der beteiligten cis- und trans-regulatorischen Faktoren. Hierbei konnte das Fehlen typischer Promotorelemente, wie einer TATA- oder CAAT-Box, sowie eine überdurchschnittlich hohe Akkumulation von GC-Nukleotiden in Form von CpG-Inseln unmittelbar stromaufwärts des Translationsstarts beider XYLT-Gene festgestellt werden. Mittels Gensynthese und PCR wurden verschiedene 5'- und 3'-trunkierte Fragmente der potentiellen Promotorbereiche generiert und in ein Reportergen-Vektorsystem inseriert. Durch eine Analyse der Aktivitäten dieser Promotorkonstrukte in der Chondrosarkomzelllinie SW1353 und der Hepatomazelllinie HepG2 konnte der für eine konstitutive Expression erforderliche Promotorbereich des XYLT1-Gens auf 797 bp und der des XYLT2-Gens auf 177 bp unmittelbar stromaufwärts des Translationsstarts eingegrenzt werden. In silico-Analysen lieferten Hinweise auf Transkriptionsfaktor (TF)-Bindestellen der AP-1- und Sp-Proteinfamilie in diesen Promotorbereichen. Die Identifizierung funktioneller TF-Bindestellen erfolgte über zielgerichtete Mutationen dieser Erkennungssequenzen. Daraus resultierende signifikante Veränderungen der Promotoraktivitäten wurden durch den direkten Nachweis von TF-DNA-Interaktionen mittels electrophoretic mobility shift assays bestätigt. Die eindeutige Identifizierung der TF erfolgte schließlich durch spezifische Antikörper gegen AP-1- und Sp-Proteine unter Einsatz von Supershift-Assays. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigten, dass die basale Aktivierung von XYLT1 durch den TF cJun/AP-1- und Sp-Proteine erfolgt. Die essentielle Beteiligung dieser TF an der Expression des XYLT1-Promotors konnte durch Verwendung spezifischer Antikörper und durch den Einsatz sequenzspezifischer siRNA gegen Sp1 und Sp3 bestätigt werden. Zudem konnte erstmalig eruiert werden, dass TF der Sp1-Proteinfamilie entscheidend an der Regulation der XYLT2-Expression beteiligt sind. Hierbei zeigte sich, dass für die konstitutive XYLT2-Expression sowie für die Feinjustierung der Transkriptionsstärke ein Zusammenwirken mehrerer Sp-Erkennungssequenzen erforderlich ist. Die Beteiligung der identifizierten TF an der transkriptionellen Regulation der nativen XYLT-Promotoren konnte zudem durch AP-1- bzw. Sp1-Inhibitoren verifiziert werden. Ein Sequenzvergleich der humanen und murinen XYLT-Promotorbereiche zeigte überdies die phylogenetische Konservierung der spezifischen AP-1- und Sp1-Transkriptionsfaktorbindestellen. Zusammenfassend konnten im Rahmen dieser Arbeit erstmals signifikante Unterschiede in der transkriptionellen Regulation der beiden XT-Isoformen aufgezeigt werden. Diese Untersuchungen können als Grundlage für die weitere Charakterisierung des divergenten Expressionsmusters dienen sowie zur Aufklärung der unterschiedlichen physiologischen Funktionen beider Xylosyltransferasen beitragen.
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Müller B. Identifizierung und funktionelle Analyse der humanen Xylosyltransferase I- und II-Promotoren. Bielefeld (Germany): Bielefeld University; 2009.
Müller, B. (2009). Identifizierung und funktionelle Analyse der humanen Xylosyltransferase I- und II-Promotoren. Bielefeld (Germany): Bielefeld University.
Müller, B. (2009). Identifizierung und funktionelle Analyse der humanen Xylosyltransferase I- und II-Promotoren. Bielefeld (Germany): Bielefeld University.
Müller, B., 2009. Identifizierung und funktionelle Analyse der humanen Xylosyltransferase I- und II-Promotoren, Bielefeld (Germany): Bielefeld University.
B. Müller, Identifizierung und funktionelle Analyse der humanen Xylosyltransferase I- und II-Promotoren, Bielefeld (Germany): Bielefeld University, 2009.
Müller, B.: Identifizierung und funktionelle Analyse der humanen Xylosyltransferase I- und II-Promotoren. Bielefeld University, Bielefeld (Germany) (2009).
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