Untersuchungen zur biochemischen Charakterisierung der humanen Xylosyltransferase I und II

Müller S (2005)
Bielefeld (Germany): Bielefeld University.

Download
OA
Bielefeld Dissertation | German
Author
Supervisor
Kleesiek, Knut (Prof. Dr. med.)
Abstract
Die vorliegenden Untersuchungen beschäftigten sich mit dem Enzym Xylosyltransferase I (EC 2.4.2.26, XT-I), welches die Biosynthese von Glykosaminoglykanen in Proteoglykanen durch den Transfer von Xylose auf spezifische Serin-Reste des Core-Proteins initiiert, und dem XT-II-Protein, dessen physiologische Funktion noch völlig unbekannt ist. Durch die Klonierung von unterschiedlichen XT-I-Mutanten konnte eine funktionelle Analyse der humanen XT-I beschrieben werden und es gelang im Rahmen dieser Arbeit erstmalig die rekombinante Darstellung der humanen XT-II in Insektenzellen. Der Basisvektor pCG255[Delta]1-148-XT-I diente als Grundlage für die Etablierung von unterschiedlichen XT-I-Mutanten, welche für die Analyse der katalytischen Aktivität, der Wechselwirkungen zwischen Enzym und Substrat und der Identifizierung der Heparin-Bindungsregion eingesetzt wurden. Es wurden 14 hochkonservierte Cystein-Codons durch gerichtete Mutagenese zu Alanin-Codons mutiert und zusätzlich aminoterminal verkürzte XT-I-Deletionsmutanten generiert. Nach heterologer Expression in High-Five-Insektenzellen wurde die katalytische Aktivität der Enzyme quantifiziert, dabei konnten 5 Cystein-Reste als essentiell für die Erhaltung einer katalytisch aktiven XT-I bestimmt werden. Die Identifizierung des minimalen Core-Proteins der XT-I erfolgte durch Expression und funktionelle Analyse von aminoterminalen Deletionsmutanten. Deletion von 272 oder mehr aminoterminalen Aminosäuren führte zu nahezu vollständig inaktiven Enzymen, während Mutanten mit maximal 260 deletierten Aminosäuren eine zur rekombinanten XT-I vergleichbare Aktivität zeigten. Durch Western-Blot-Analyse konnte weiterhin nachgewiesen werden, dass die rekombinante XT-I in aktiver Form als Monomer vorliegt und keine Dimerisierung erfolgt. Außerdem konnte gezeigt werden, dass die rekombinante XT-I keine freien Cystein-Reste besitzt. Für die Heparin-Bindungsregion der XT-I konnte eine dreidimensionale Struktur ausgeschlossen und ein potentielles Sequenzmotiv in Position Pro721 bis Ile727 beschrieben werden. Die humane XT-II wurde innerhalb dieser Arbeit erstmalig rekombinant in E. coli und in High-Five-Zellen exprimiert und ein stabiler Insektenzellklon konnte etabliert werden. Die Bestätigung der Spezifität der XT-II-Klone erfolgte durch den immunochemischen Nachweis der Xylosyltransferasen im Zellkulturüberstand mit polyklonalem Kaninchen-Antiserum gegen ein XT-I-homologes Peptid und einem monoklonalen Anti-V5-Antikörper. Die XT-I- und XT-II-Genexpression der Insektenzellklone konnte durch eine Real-Time PCR-Methode quantifiziert werden. Durch die rekombinante Expression konnte die Grundlage für die Aufklärung der Funktion der XT-II geschaffen werden. Für phylogenetische Untersuchungen der Xylosyltransferasen wurde das XT-Enzym einer evolutionär alten Spezies analysiert. Die XT aus dem Blauhai ist ebenso wie die humane XT-I in vitro dazu in der Lage, Xylose auf Seidenfibroin zu transferieren. Im Unterschied zum humanen Enzym erwies sich der Akzeptor Bikunin für die Hai-XT als nicht geeignet, ein weiterer Unterschied zeigte sich bei der Analyse der Inhibition durch Heparin. Hai-XT zeigte auch bei Zusatz von 1000 IU/ml Heparin noch eine Restaktivität von 83 v.H., während bei der humanen XT-I schon 1 IU/ml Heparin für eine vollständige Inhibition ausreichen. Die Inhibition durch UDP erfolgte vergleichbar dem humanen Enzym und lässt daraus schließen, dass die Bindungsregion für den Nukleotid-Zucker evolutionär hochkonserviert ist.
Year
PUB-ID

Cite this

Müller S. Untersuchungen zur biochemischen Charakterisierung der humanen Xylosyltransferase I und II. Bielefeld (Germany): Bielefeld University; 2005.
Müller, S. (2005). Untersuchungen zur biochemischen Charakterisierung der humanen Xylosyltransferase I und II. Bielefeld (Germany): Bielefeld University.
Müller, S. (2005). Untersuchungen zur biochemischen Charakterisierung der humanen Xylosyltransferase I und II. Bielefeld (Germany): Bielefeld University.
Müller, S., 2005. Untersuchungen zur biochemischen Charakterisierung der humanen Xylosyltransferase I und II, Bielefeld (Germany): Bielefeld University.
S. Müller, Untersuchungen zur biochemischen Charakterisierung der humanen Xylosyltransferase I und II, Bielefeld (Germany): Bielefeld University, 2005.
Müller, S.: Untersuchungen zur biochemischen Charakterisierung der humanen Xylosyltransferase I und II. Bielefeld University, Bielefeld (Germany) (2005).
Müller, Sandra. Untersuchungen zur biochemischen Charakterisierung der humanen Xylosyltransferase I und II. Bielefeld (Germany): Bielefeld University, 2005.
Main File(s)
Access Level
OA Open Access

This data publication is cited in the following publications:
This publication cites the following data publications:

Export

0 Marked Publications

Open Data PUB

Search this title in

Google Scholar