Analyse von Glykosaminoglykanen in humanen Zellen und Körperflüssigkeiten

Ambrosius M (2008)
Bielefeld (Germany): Bielefeld University.

Download
OA
Bielefeld Dissertation | German
Author
Supervisor
Kleesiek, Knut (Prof. Dr. med.)
Abstract
Glycosaminoglycans (GAGs) are found mainly in connective tissue as constituents of proteoglycans, covalently linked to the core protein. They participate in and regulate several cellular events and physiological processes. The sequence of [Delta]-disaccharides in GAGs is crucial for their proper function. The human xylosyltransferases XT-I and XT-II catalyse the initial and rate-limiting step in the biosynthesis of GAGs by the transfer of xylose to selected serine residues in the core protein of proteoglycans (PGs). For the analysis of GAGs, a HPLC method facilitating the separation of 16 [Delta]-disaccharide standards derivatized with the fluorophore 2-aminoacridone was developed. This novel method allows the quantitative analysis of the [Delta]-disaccharide composition of hyaluronic acid (HA), chondroitin sulfate (CS), dermatan sulfate (DS), heparan sulfate (HS) and heparin (H). The method represents the first HPLC application ever to accomplish baseline separation of either seven [Delta]-disaccharides from HS/H or nine [Delta]-disaccharides from CS/DS/HA with one column and buffer system after fluorophore labeling in two runs. This is also the first HPLC method achieving the separation of all nine fluorophore-labeled GAG [Delta]-disaccharides from CS/DS/HA in one run. The run times are shorter compared to any existing HPLC separation of labeled GAG [Delta]-disaccharides from either CS/DS/HA or HS/H. Since only conventional HPLC apparatus is needed our method can be used for routine GAG disaccharide analysis in every laboratory. In order to evaluate the newly developed method, GAGs from different blood cells were characterized. Optimized methods with good recovery and high purity were developed for the purification of platelets and granulocytes using gradient centrifugation and were successfully applied. The average purities were 99.4 per cent for platelet samples and 98.3 per cent for granulocyte samples. For the first time, normal ranges of the GAG [Delta]-disaccharide compositions from platelets and granulocytes were determined. The composition of GAG [Delta]-disaccharides from granulocytes was characterized for the first time and [Delta]di-mono4S_CS und [Delta]di-0S_HA were identified as the main components. Furthermore, the [Delta]-disaccharide compositions of GAGs from 22 different human cell lines were analysed for differences in the total GAG amount between the investigated adherent and suspension cell lines. For the 5 suspension cell lines investigated (blastoma cell lines and hematological cancer cell lines), a significantly decreased total GAG amount was found compared to the 17 adherent cell lines (carcinoma cell lines, sarcoma cell lines and fibroblast cell lines) (p = 0.03). The amounts of HA, CS/DS and HS/H were decreased in the suspension cell lines with only the amount of HS/H being significantly decreased (p = 0.037) in suspension cell lines in comparison with adherent cell lines. The percentage of [Delta]di-mono0S_HS was found to be significantly decreased (p = 0.006) in suspension cell lines compared to adherent cell lines. The percentage of [Delta]di-di(6,N)S_HS was significantly increased (p = 0.0002) in suspension cell lines in comparison with adherent cell lines. [Delta]di-mono6S_HS and [Delta]di-di(2,N)S_HS were exclusively detected in the adherent cell lines. In order to examine changes in the serum GAGs concentration and composition caused by polymorphisms in the xylosyltransferase genes XYLT1 and XYLT2, 223 blood donors were screened for 3 missense polymorphisms in XYLT1 and XYLT2. 48 samples comprising 23 case samples in which one of the missense mutations had been found and 25 wildtype/control samples were analyzed for their serum GAGs and XT activity. Here, it could be shown that the SNP c.343G>T is associated with a significantly (p<0.01) reduced GAG amount compared to the wildtype group.

Glykosaminoglykane (GAGs) sind nicht nur Bestandteile der extrazellulären Matrix, sondern übernehmen darüber hinaus als Bestandteil von Proteoglykanen wichtige Funktionen bei der Vermittlung und Steuerung von Zell-Zell- und Zell-Matrix-Interaktionen. Dabei spielt die Abfolge der [Delta]-Disaccharide in den GAGs eine entscheidende Rolle für die Funktion. Die humanen Xylosyltransferasen XT-I und XT-II katalysieren den initialen und geschwindigkeitsbestimmenden Schritt bei der Bildung der GAGs am Core-Protein von Proteoglykanen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine HPLC-Methode entwickelt, um 16 verschiedene GAG [Delta]-Disaccharide nach Derivatisierung mit dem Fluorophor 2-Aminoacridon quantitativ zu bestimmen. Damit können die GAGs Hyaluronsäure (HA), Chondroitinsulfat (CS), Dermatansulfat (DS), Heparansulfat (HS) und Heparin (H) quantitativ in ihrer [Delta]-Disaccharid-Zusammensetzung analysiert werden. Im Vergleich zu allen vorherigen HPLC-Methoden zur Trennung derivatisierter [Delta]-Disaccharide wurden mit der neuen Methode erstmalig 16 verschiedene [Delta]-Disaccharide in zwei Trennläufen mit nur einem Puffersystem und einer Säule unter Basislinientrennung der Peaks aufgetrennt. Zusätzlich konnten erstmalig alle 9 kommerziell erhältlichen [Delta]-Disaccharide der GAGs HA, CS und DS nach Markierung mit einem Fluorophor in einem singulären HPLC-Lauf aufgetrennt werden. Weiterhin konnten die benötigten Zeiträume für den Trennlauf der [Delta]-Disaccharide von HA, CS und DS sowie den Trennlauf der [Delta]-Disaccharide von HS und H in Relation zu allen vergleichbaren Literaturmethoden deutlich verkürzt werden. Die Isolierung und Analyse von GAGs aus Blutzellen erfolgte zur Erstcharakterisierung und zur Untersuchung der Eignung bestimmter Blutzellen als Probenmaterial für die GAG-Analytik. Um Thrombozyten und Granulozyten mit hoher Reinheit und Zellzahl aus dem Vollblut von Blutspendern zu isolieren, wurden optimierte Aufreinigungsmethoden mit Dichtegradientenzentrifugation entwickelt und erfolgreich eingesetzt. Die durchschnittliche Reinheit betrug für die Thrombozytenproben 99,4 Prozent und für die Granulozytenproben 98,3 Prozent. Es wurde zum ersten Mal der Normalbereich der GAG [Delta]-Disaccharide in Thrombozyten und Granulozyten bestimmt. Es erfolgte die Erstcharakterisierung der [Delta]-Disaccharide von GAGs in Granulozyten mit dem Nachweis von [Delta]di-mono4S_CS und [Delta]di-0S_HA als Hauptkomponenten. Die GAG [Delta]-Disaccharide von 22 verschiedenen, humanen Zellkulturzelllinien wurden zur Erstcharakterisierung und zu Vergleichen zwischen Zelllinien verschiedener Gewebetypen analysiert. Es wurde ein signifikant verminderter GAG-Gehalt in den 5 untersuchten Suspensionszelllinien (Blastome, hämatoonkologische Tumorzelllinien) im Vergleich zu den 17 adhärenten Zelllinien (Karzinome, Sarkome, Fibroblasten) vorgefunden (p = 0,03). Dabei waren insbesondere die Werte für die GAGs HS/H in Suspensionszellen erniedrigt. Des Weiteren zeigte sich in Suspensionszelllinien für das [Delta]-Disaccharid [Delta]di-0S_HS ein signifikant erniedrigter (p = 0,006) und für [Delta]di-di(6,N)S_HS ein signifikant erhöhter (p = 0,0002) prozentualer Anteil an der Komposition von HS/H im Vergleich zu den adhärenten Zelllinien. Die [Delta]-Disaccharide [Delta]di-mono6S_HS und [Delta]di-di(2,N)S_HS wurden ausschließlich in den adhärenten Zelllinien detektiert. Zur Untersuchung eines möglichen Einflusses von Polymorphismen der Xylosyltransferase (XYLT)-Gene auf die GAG-Konzentration und GAG-Komposition im Serum wurden 223 Blutspender auf 3 Polymorphismen in XYLT1 und XYLT2 untersucht, die jeweils mit einer Aminosäure-Substitution einhergehen. Bei 23 Proben mit einem der drei Polymorphismen und 25 Kontrollproben erfolgte die Analyse der GAG [Delta]-Disaccharide im Serum. Dabei zeigte sich eine signifikante Assoziation (p<0,01) zwischen dem Polymorphismus XYLT1 Exon 1 c.343G>T und erniedrigten Werten für die GAG-Konzentration im Serum im Vergleich zum Wildtyp.
Year
PUB-ID

Cite this

Ambrosius M. Analyse von Glykosaminoglykanen in humanen Zellen und Körperflüssigkeiten. Bielefeld (Germany): Bielefeld University; 2008.
Ambrosius, M. (2008). Analyse von Glykosaminoglykanen in humanen Zellen und Körperflüssigkeiten. Bielefeld (Germany): Bielefeld University.
Ambrosius, M. (2008). Analyse von Glykosaminoglykanen in humanen Zellen und Körperflüssigkeiten. Bielefeld (Germany): Bielefeld University.
Ambrosius, M., 2008. Analyse von Glykosaminoglykanen in humanen Zellen und Körperflüssigkeiten, Bielefeld (Germany): Bielefeld University.
M. Ambrosius, Analyse von Glykosaminoglykanen in humanen Zellen und Körperflüssigkeiten, Bielefeld (Germany): Bielefeld University, 2008.
Ambrosius, M.: Analyse von Glykosaminoglykanen in humanen Zellen und Körperflüssigkeiten. Bielefeld University, Bielefeld (Germany) (2008).
Ambrosius, Michael. Analyse von Glykosaminoglykanen in humanen Zellen und Körperflüssigkeiten. Bielefeld (Germany): Bielefeld University, 2008.
Main File(s)
Access Level
OA Open Access

This data publication is cited in the following publications:
This publication cites the following data publications:

Export

0 Marked Publications

Open Data PUB

Search this title in

Google Scholar