Etablierung und Optimierung der synthetischen primär-microRNA Technik für funktionale Genomanalysen in Arabidopsis thaliana

Niemeier S (2010)
Bielefeld (Germany): Bielefeld University.

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OA
Bielefeld Dissertation | German
Author
Supervisor
Merkle, Thomas (PD Dr.)
Abstract
MicroRNAs (miRNAs) sind eine Klasse kleiner, nicht kodierender RNAs in Eukaryoten, die die Regulation ihrer Zielgene (targets) durch Spaltung der Transkripte oder Inhibition der Translation auf post-transkriptioneller Ebene vermitteln. miRNAs werden aus größeren, strukturell definierten Primärtranskripten prozessiert und zeigen in Pflanzen hohe Komplementarität zu den Zielsequenzen ihrer targets. Diese Eigenschaften können ausgenutzt werden, um künstliche oder synthetische miRNAs (amiRNAs oder smiRNAs) für gewünschte Gene oder Genfamilien zu exprimieren und deren (simultanen) knockdown herbeizuführen. In dieser Arbeit wurde das miRNA Vorhersageprogramm RNAhybrid genutzt, um das Design von smiRNAs zu optimieren. Es diente der hochspezifischen Vorhersage von off-targets für eine smiRNA und trug so zur Auswahl geeigneter smiRNA-Kandidaten bei. Eine weitere Optimierung der smiRNA-Technik bestand in der Generierung eines Vektors ("easy-cloning" Vektor, ECV), der die Klonierung eines smiRNA-Primärtranskriptes in einem Ein-Schritt-Verfahren erlaubte. Durch Insertion neuer Schnittstellen in das Primärtranskript der natürlichen MIR159a konnten die neuen smiRNA- und die komplementären smiRNA*-Sequenzen auf vereinfachte und beschleunigte Weise eingefügt werden. Für die Validierung des Ansatzes wurde eine smiRNA für das Chalkonsynthase-Gen (CHS) in Arabidopsis entworfen. Die pri-smiRNA(CHS) wurde auf konventionelle Art sowie mit Hilfe des ECV-Ansatzes generiert und in Arabidopsis exprimiert. Einige transgene Pflanzen zeigten starke phänotypische Auffälligkeiten. Sekundärmetabolite wie Proanthocyanidine, Anthocyane und Flavonole, zu deren Produktion die CHS in Pflanzen katalysiert, waren in den verschiedenen untersuchten Linien unterschiedlich stark reduziert. Einige Linien ähnelten eher dem Wildtypphänotyp, andere erreichten fast die phänotypischen Ausprägungen, die für chs Mutanten beobachtet werden. In diesen Linien war die stärkste Reduktion der Flavonoide und der CHS-Transkriptmengen zu beobachten, was negativ mit der Expressionsstärke des smiRNA(CHS) precursors korrelierte. Der ECV-Ansatz war ebenso effektiv wie die konventionelle Strategie. Ein vorhergesagtes off-target für die smiRNA(CHS), das durch andere Mittel nicht gefunden wurde, konnte anhand von Expressionsstudien bestätigt werden. Die Transkriptmenge dieses Gens war in den untersuchten Linien reduziert, erreichte aber nicht das geringe Niveau wie die CHS-Transkripte in den gleichen Linien. Um das Design von smiRNAs weiterhin zu optimieren, wurden verschiedene Varianten der smiRNA(CHS) in Pflanzen exprimiert. Diese bildeten Hybridstrukturen mit der Zielsequenz aus, die sich entweder durch einzelne Fehlpaarungen oder einen gesteigerten Anteil an G:U-Paarungen auszeichneten. So sollte untersucht werden, welche Veränderungen toleriert werden können, damit die Regulierung des Zielgens noch gewährleistet war und welche strukturellen Eigenschaften zur Vermeidung von off-targets beitragen können. Molekulare und phänotypische Analysen der verschiedenen transgenen Linien zeigten eine Reduzierung der CHS-Transkriptmenge sowie resultierende Phänotypen in Pflanzen, die die smiRNA(CHS) mit einer Fehlpaarung im 5'-Bereich der smiRNA exprimierten. Doch die hohe Effektivität der perfekt gepaarten smiRNA(CHS) wurde nicht erreicht. Für die übrigen Varianten wurde nur ein begrenzter silencing Effekt beobachtet. Die optimierte smiRNA-Technik wurde weiterhin für den multiplen knockdown von Genen angewandt, die für eine kleine Familie von Poly(A)-bindenden Proteinen (PABPCs) in Arabidopsis kodieren. Drei verschiedene smiRNAs wurden generiert und in Pflanzen exprimiert, die jeweils unterschiedliche Kombinationen der PABPC-Gene zum target hatten. Die stärksten Phänotypen zeigten Pflanzen, in denen fünf Gene gleichzeitig herunterreguliert waren. Sie waren deutlich kleiner als Wildtyppflanzen und in ihrem Wachstum verzögert. Rosettenblätter waren auffallend gewellt, Infloreszenzen verkürzt und die Pflanzen blühten später als Wildtypen. Transgene Linien, in denen nur drei PABPC-Gene durch smiRNAs reguliert wurden, zeigten sehr milde Phänotypen oder glichen Wildtyppflanzen, so dass auf redundante Funktionen der einzelnen Familienmitglieder geschlossen werden kann. Untersuchungen zur Lokalisierung von Poly(A)-RNA in Pflanzen mit drastischen phänotypischen Effekten zeigten, dass mRNA hier verstärkt im Zellkern akkumulierte. Gleiches wurde für Wildtyppflanzen beobachtet, die mit Leptomycin B behandelt wurden. Diese Ergebnisse lassen darauf schließen, dass die PABPCs in direkter oder indirekter Weise am Export von mRNPs beteiligt sind, höchstwahrscheinlich über den Exportin1-vermittelten Transportweg.
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Niemeier S. Etablierung und Optimierung der synthetischen primär-microRNA Technik für funktionale Genomanalysen in Arabidopsis thaliana. Bielefeld (Germany): Bielefeld University; 2010.
Niemeier, S. (2010). Etablierung und Optimierung der synthetischen primär-microRNA Technik für funktionale Genomanalysen in Arabidopsis thaliana. Bielefeld (Germany): Bielefeld University.
Niemeier, S. (2010). Etablierung und Optimierung der synthetischen primär-microRNA Technik für funktionale Genomanalysen in Arabidopsis thaliana. Bielefeld (Germany): Bielefeld University.
Niemeier, S., 2010. Etablierung und Optimierung der synthetischen primär-microRNA Technik für funktionale Genomanalysen in Arabidopsis thaliana, Bielefeld (Germany): Bielefeld University.
S. Niemeier, Etablierung und Optimierung der synthetischen primär-microRNA Technik für funktionale Genomanalysen in Arabidopsis thaliana, Bielefeld (Germany): Bielefeld University, 2010.
Niemeier, S.: Etablierung und Optimierung der synthetischen primär-microRNA Technik für funktionale Genomanalysen in Arabidopsis thaliana. Bielefeld University, Bielefeld (Germany) (2010).
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