Analyse und Visualisierung eines R2R3-MYB / bHLH Transkriptionsfaktorkomplexes aus Arabidopsis thaliana

Düttmann V (2008)
Bielefeld (Germany): Bielefeld University.

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OA
Bielefeld Dissertation | German
Author
Supervisor
Weisshaar, Bernd
Abstract
The regulation of flavonoid biosyntheses in the model plant Arabidopsis thaliana is well characterized already. A regulated procedure of biosynthesis without frictionless and functional cooperation of many regulatory transcription factors is not possible. In this work, three different transcription factors were analysed in detail, MYB75 as well as BHLH2/BHLH42 and TTG1. These are regulators of the dihydroflavonol-reductase (DFR), the key enzyme of the anthocyanin biosynthesis. To understand the regulatory mechanism, binding of transcription factors among each other and to the target-DNA was analyzed with new methods from the physics like fluorescence correlation spectroscopy (FCS) or fluorescence resonance energy transfer (FRET). With FCS and recombinant expressed proteins, promoter attachment sites of the transcription factor complex were identified. Simultaneous binding of both transcription factors to specific binding sites was shown, while binding of single transcription factors has not been observed. To visualize the localization and interaction of the transcription factors among each other and to the promoter DNA in plant cells, transcription factors were fused to fluorescent proteins (eGFP, mCherry). With transient protoplast transfection and stable plant transfection, functionality and localization of fusion proteins was shown in plant cells (protoplasts and seedlings). MYB proteins showed accumulation ubiquitous in cells, while bHLH proteins are exclusively located in the nucleus. Complementation lines and promoter-GUS-lines showed expression of bHLH factors in all organs of young seedlings. MYB75 expression is shown mainly in hypocotyl cells only with sucrose treatment. Transcription factor mutant plants are able to complement with fusion proteins expressed under the control of the native promoter. Interaction studies with FRET and bimolecular fluorescence complementation (BiFC) have validated interaction of the proteins among each other in the nucleus of plant cells. BHLH proteins showed homodimerization as well as heterodimerization with different members of subgroup IIIf, while MYB proteins are only able to interact with bHLH proteins.

An dem Modellorganismus Arabidopsis thaliana ist die Regulation der Flavonoidbiosynthese seit längerem Gegenstand moderner Forschung und bereits gut untersucht. Ohne das reibungslose und funktionelle Zusammenspiel vieler regulatorischer Transkriptionsfaktoren ist ein geregelter Ablauf des Stoffwechsels nicht möglich. Im Rahmen dieser Arbeit wurden besonders drei Transkriptionsfaktoren als Regulatoren der Dihydroflavonol-Reduktase (DFR), des Schlüsselenzyms der Anthocyanbiosynthese, in Augenschein genommen, MYB75, sowie BHLH2/BHLH42 und TTG1. Um diese Regulationsmechanismen zu verstehen, wurde in dieser Arbeit die Bindung der Transkriptionsfaktoren untereinander sowie an ihre Ziel-DNA mit Hilfe neuer Methoden aus der Physik wie der Fluoreszenz-Korrelationsspektroskopie (FCS) oder der Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer-Methode (FRET) untersucht. Mittels FCS und der Expression rekombinanter Proteine konnten die Promotor-Bindestellen des Transkriptionsfaktorkomplexes identifiziert werden. Dabei konnte gezeigt werden, dass beide Transkriptionsfaktoren gemeinsam und nicht einzeln an die DNA binden. Zur Visualisierung der Lokalisation und der Wechselwirkungen der Transkriptionsfaktoren untereinander sowie an die Promotor DNA in lebenden Zellen (Protoplasten und Keimlinge) wurden mit fluoreszierenden Proteinen (eGFP, mCherry) genetisch markierte Transkriptionsfaktoren transient oder stabil in Pflanzenzellen eingebracht. Hiermit konnte neben der biologischen Funktionalität der Fusionsproteine auch deren Lokalisation in der Zelle gezeigt werden. MYB-Proteine akkumulieren ubiquitär in der Zelle, während bHLH-Proteine ausschließlich im Zellkern lokalisiert sind. Stabile Komplementationslinien zeigen, ebenso wie Promotor-GUS-Linien, eine Expression der bHLH-Faktoren in allen Organen junger Keimlinge. Dabei beschränkt sich die Akkumulation auf den Zellkern. MYB75 wird unter Einfluss von Saccharose-Zugabe in hauptsächlich Hypokotylzellen von Keimlingen exprimiert. Die Fusionsproteine können unter der Kontrolle des jeweiligen nativen Promotors die Transkriptionsfaktor knock-out Mutanten komplementieren. In Interaktionsstudien mittels FRET und bimolekularer Fluoreszenzkomplementation (BiFC) wurde die Wechselwirkung der Proteine untereinander im Zellkern der lebenden Zellen bestätigt. Dabei können bHLH-Proteine sowohl miteinander als auch mit weiteren Faktoren der gleichen Subgruppe interagieren, während MYB-Proteine lediglich mit bHLH-Faktoren einen Komplex eingehen können.
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Düttmann V. Analyse und Visualisierung eines R2R3-MYB / bHLH Transkriptionsfaktorkomplexes aus Arabidopsis thaliana. Bielefeld (Germany): Bielefeld University; 2008.
Düttmann, V. (2008). Analyse und Visualisierung eines R2R3-MYB / bHLH Transkriptionsfaktorkomplexes aus Arabidopsis thaliana. Bielefeld (Germany): Bielefeld University.
Düttmann, V. (2008). Analyse und Visualisierung eines R2R3-MYB / bHLH Transkriptionsfaktorkomplexes aus Arabidopsis thaliana. Bielefeld (Germany): Bielefeld University.
Düttmann, V., 2008. Analyse und Visualisierung eines R2R3-MYB / bHLH Transkriptionsfaktorkomplexes aus Arabidopsis thaliana, Bielefeld (Germany): Bielefeld University.
V. Düttmann, Analyse und Visualisierung eines R2R3-MYB / bHLH Transkriptionsfaktorkomplexes aus Arabidopsis thaliana, Bielefeld (Germany): Bielefeld University, 2008.
Düttmann, V.: Analyse und Visualisierung eines R2R3-MYB / bHLH Transkriptionsfaktorkomplexes aus Arabidopsis thaliana. Bielefeld University, Bielefeld (Germany) (2008).
Düttmann, Verena. Analyse und Visualisierung eines R2R3-MYB / bHLH Transkriptionsfaktorkomplexes aus Arabidopsis thaliana. Bielefeld (Germany): Bielefeld University, 2008.
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