Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer-basierter spezifischer Nachweis von mRNA in vitro und in situ

Palmisano R (2003)
Bielefeld (Germany): Bielefeld University.

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OA
Bielefeld Dissertation | German
Author
Supervisor
Schmitt-John, Thomas (PD Dr.)
Abstract
In den letzten Jahren sind große Fortschritte auf dem Gebiet der molekularen Diagnostik erzielt worden. Die molekulargenetischen Grundlagen vieler de novo oder erblich auftretender Erkrankungen bei Föten konnten eingegrenzt oder aufgeklärt werden. Dies hat zu verbesserter und aussagekräftigerer vorgeburtlicher Befundung in der Folge nicht-invasiver und invasiver Diagnostik geführt. Unbefriedigend ist die derzeitige Situation, dass keine risikofreie nicht-invasive Routine zur Erlangung fötalen Zellmaterials zur Verfügung steht. Bei der Separation humaner Zelltypen spielt die Bindung von fluoreszenzmarkierten Antikörpern oder Liganden und anschließende Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung eine wichtige Rolle. Diese Markierungen sind jedoch nicht in jedem Falle von ausreichender Spezifität und damit Selektivität hinsichtlich der gesuchten Zellen. Eine andere Möglichkeit der selektiven Identifikation einer Zelle bestimmter Herkunft kann der Expressionsstatus ausgewählter Gene sein. Die Korrelation der Aktivität eines spezifischen Gens mit Herkunft und Typ der Zelle muss zweifelsfrei und einzigartig sein. Wenn sich dieses Transkriptionsprodukt in situ eindeutig nachweisen ließe, hätte man eine Methode, die hochspezifisch wäre, wenn gleichzeitig falsch positive Signale ausgeschlossen werden können. Eine Methode, die aufgrund ihrer Wirkungsweise dafür geeignet scheint, ist die Transfektion mit fluoreszenzmarkierten Antisense-Oligonucleotiden, welche nach Hybridisierung an die Ziel mRNA einen Fluoreszenz Resonanz Energie Transfer (FRET) erzeugen können. In dieser Arbeit wird untersucht, ob durch eine solche in situ Hybridisierung von DNA-Oligonucleotiden an mRNA ein FRET-Signal erzeugt werden kann, das außerhalb der Zelle detektierbar ist. Daher teilt sich die Arbeit in zwei Schwerpunkte auf. In dem einen Teil wurden fluoreszenzmarkierte DNA-Oligonucleotide hinsichtlich der optimalen Parameter für einen FRET untersucht, der im sichtbaren Wellenlängenbereich detektierbar sein muss. Diese Untersuchungen wurden mit Hilfe der Anregungs-Emissions-Spektroskopie (AES) durchgeführt, die eine zweidimensionale Aufnahme von Fluoreszenzspektren ermöglicht. Hierbei wurde gezeigt, dass die Kombination der beiden Fluorophore Bodipy493/503 und Texas-Red den stärksten FRET aus einer untersuchten Gruppe von jeweils fünf verschiedenen Donor- und Akzeptor-Fluorophoren erzeugt. Es wurde auch gezeigt, dass geeignete DNA-Oligonucleotide jeweils eine Länge von mindestens 25 Nucleotiden und einen hohen GC-Gehalt aufweisen sollten, um die Stabilität der Hybridisierung zu gewährleisten als auch Sequenzhomologien, die zu Fehlpaarungen führen, auszuschließen. Es wurde des weiteren gezeigt, dass sich Phosphothioat-modifizierte DNA-Oligonucleotide in ihren spektroskopischen Eigenschaften nicht von unmodifizierten unterscheiden. Im zweiten Teil der Arbeit wurden die Möglichkeiten der Transfektion von Zellen mit Antisense-Oligonucleotiden untersucht. Es wurden verschiedene physikalische und chemische Transfektionsmethoden verglichen und nach einer geeigneten Fixierungsmethode gesucht, welche die Zellen für weitere Untersuchungen stabilisiert. Als Modellsystem wurde die chronisch myelogene Leukämie-Zelllinie K-562 ausgewählt, die nach Induktion stabil die fötalen [epsilon]- und [gamma]-Globin Gene exprimiert. Als beste Methode hat sich die Transfektion der Zellen mit Phosphothioat-modifizierten Oligonucleotiden und dem kationischen Transfektionsmittel Oligofectamine sowie nachfolgender Paraformaldehyd/Eisessig Fixierung herausgestellt. Die Zellen wurden mit einem Confokalen Laser Scanning Mikroskop untersucht und der FRET in den Zellen durch "Akzeptor-Bleichung" nachgewiesen und quantifiziert. Als Negativkontrollen dienten zum einen Sense-Oligonucleotide der jeweiligen Sequenzen und eine zweite Zelllinie, die keine Globin Gene exprimiert und mit den Antisense-Oligonucleotiden transfiziert wurde.
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Palmisano R. Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer-basierter spezifischer Nachweis von mRNA in vitro und in situ. Bielefeld (Germany): Bielefeld University; 2003.
Palmisano, R. (2003). Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer-basierter spezifischer Nachweis von mRNA in vitro und in situ. Bielefeld (Germany): Bielefeld University.
Palmisano, R. (2003). Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer-basierter spezifischer Nachweis von mRNA in vitro und in situ. Bielefeld (Germany): Bielefeld University.
Palmisano, R., 2003. Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer-basierter spezifischer Nachweis von mRNA in vitro und in situ, Bielefeld (Germany): Bielefeld University.
R. Palmisano, Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer-basierter spezifischer Nachweis von mRNA in vitro und in situ, Bielefeld (Germany): Bielefeld University, 2003.
Palmisano, R.: Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer-basierter spezifischer Nachweis von mRNA in vitro und in situ. Bielefeld University, Bielefeld (Germany) (2003).
Palmisano, Ralf. Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer-basierter spezifischer Nachweis von mRNA in vitro und in situ. Bielefeld (Germany): Bielefeld University, 2003.
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