Lokalisationsmikroskopie mit mehreren Farben und ihre Anwendung in biologischen Präparaten

Gunkel M (2011)
Bielefeld (Germany): Bielefeld University.

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OA
Bielefeld Dissertation | German
Author
Supervisor
Sauer, Markus (Prof. Dr.)
Alternative Title
Localization microscopy with multiple colors and its application in biological samples
Abstract
Fluorescence microscopy is an important method for studying biological structures. By intrinsic properties of the fluorophores it is possible to separate and individually localize their signals. These quantitative position information enable an improved structural resolution and a statistic analysis of the data. In this thesis, localization microscopy was applied for multiple spectral markers within the observed biological samples. Several algorithms to compensate mechanical and chromatic shift and to correct and analyze the position data were developed. For example, the relative distribution of a structural protein of the DNA (H2A) and a DNA remodeler protein (SNF2h) was examined. The experimental results were compared with random distributed signal positions within the same global structures. It could be shown that the real distributions are significantly different from the random ones. It is also possible to check the data for signal clusters and determine their properties. This was first tested on simulated distributions and later applied in the analysis of signal accumulations in biological structures like centromere protein clusters (CENP- A, CENP-B and CENP-C) within the human kinetochore. In addition, the axial position of the localization data within the structure can be determined with a precision of about 50nm. A model for the distribution of the fluorophores in tobacco mosaic virus structures was developed and fitted to the data. The width of these structures determined by electron microscopy to be 18nm could be confirmed. The mean localization accuracy in this case was 8nm. A new microscope setup was build to split the fluorescence signal emitted by the sample due to its different properties like direction of polarization or spectral range. Both parts of the signal could be imaged simultaneously on the same detector. This results in a shorter acquisition time for a two color measurement. Additionally, no mechanical drift between two measurements is apparent.

Die Fluoreszenzmikroskopie ist eine wichtige Methode zur Erforschung biologischer Strukturen. Durch intrinsische Eigenschaften der Fluorophore ist es möglich, deren Signale voneinander zu trennen und individuell zu lokalisieren. Hierdurch erhält man quantitative Positionsinformationen, was zu einer Verbesserung der strukturellen Auflösung führt und die Möglichkeit statistischer Analysen eröffnet. In dieser Arbeit wurde die Lokalisationsmikroskopie für spektral verschiedene Markierungen innerhalb biologischer Präparate angewandt. Es wurden verschiedene Algorithmen entwickelt, um den mechanischen und chromatischen Versatz der erhaltenen Positionsdaten zu korrigieren und diese weiter zu analysieren. Beispielsweise wurde die relative Verteilung zwischen einem DNA-Strukturprotein (H2A) zu einem am DNA-Umbau beteiligten Protein (SNF2h) untersucht. Gleichzeitig wurden diese Verteilungen mit zufälligen Verteilungen von Signalpositionen innerhalb der gleichen globalen Strukturen verglichen. Dadurch konnte gezeigt werden, dass sich die Verteilungen signifikant von zufälligen Verteilungen unterscheiden. Die Fluoreszenzmikroskopie ist eine wichtige Methode zur Erforschung biologischer Strukturen. Durch intrinsische Eigenschaften der Fluorophore ist es möglich, deren Signale voneinander zu trennen und individuell zu lokalisieren. Hierdurch erhält man quantitative Positionsinformationen, was zu einer Verbesserung der strukturellen Auflösung führt und die Möglichkeit statistischer Analysen eröffnet. Weiterhin ist es möglich, die Daten auf Signalanhäufungen zu überprüfen und deren Eigenschaften zu bestimmen. Dies wurde erst an simulierten Verteilungen getestet und später unter anderem zur Analyse von Signalanhäufungen von Centromerproteinen (CENP-A, CENP-B und CENP-C) im menschlichen Kinetochor genutzt. Zusätzlich kann die axiale Position der Lokalisationsdaten innerhalb der Struktur auf etwa 50 nm genau bestimmt werden. Für die Verteilung der Fluorophore in Tabakmosaikviren wurde ein Modell entwickelt, welches an die experimentellen Daten angepasst wurde. Durch die Lokalisationsmikroskopie konnte die elektronenmikroskopisch bestimmte Breite dieser Struktur von 18 nm bestätigt werden. Die Positionsgenauigkeit der einzelnen Signalpositionen betrug in diesem Fall im Mittel 8 nm. Um das von der Probe emittierte Fluoreszenzsignal aufgrund verschiedener Eigenschaften, wie beispielsweise unterschiedliche Polarisationsrichtungen oder verschiedene Spektralbereiche, aufzuspalten und simultan auf einem einzigen Detektor abzubilden wurde ein neuer Mikroskopaufbau realisiert. Hierdurch kann die Aufnahme einer Zweifarbenmessung beschleunigt werden, da beide Farbkanäle gleichzeitig detektiert werden. Ein weiterer Vorteil ist, dass kein mechanischer Versatz zwischen beiden Messungen entsteht.
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Gunkel M. Lokalisationsmikroskopie mit mehreren Farben und ihre Anwendung in biologischen Präparaten. Bielefeld (Germany): Bielefeld University; 2011.
Gunkel, M. (2011). Lokalisationsmikroskopie mit mehreren Farben und ihre Anwendung in biologischen Präparaten. Bielefeld (Germany): Bielefeld University.
Gunkel, M. (2011). Lokalisationsmikroskopie mit mehreren Farben und ihre Anwendung in biologischen Präparaten. Bielefeld (Germany): Bielefeld University.
Gunkel, M., 2011. Lokalisationsmikroskopie mit mehreren Farben und ihre Anwendung in biologischen Präparaten, Bielefeld (Germany): Bielefeld University.
M. Gunkel, Lokalisationsmikroskopie mit mehreren Farben und ihre Anwendung in biologischen Präparaten, Bielefeld (Germany): Bielefeld University, 2011.
Gunkel, M.: Lokalisationsmikroskopie mit mehreren Farben und ihre Anwendung in biologischen Präparaten. Bielefeld University, Bielefeld (Germany) (2011).
Gunkel, Manuel. Lokalisationsmikroskopie mit mehreren Farben und ihre Anwendung in biologischen Präparaten. Bielefeld (Germany): Bielefeld University, 2011.
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