Bead-basierte Fluoreszenz-Immunoassays zum Nachweis tumorinduzierter Proteine

Scheffler S (2007)
Bielefeld (Germany): Bielefeld University.

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Bielefeld Dissertation | German
Author
Supervisor
Sauer, Markus (Prof. Dr.)
Alternative Title
Bead-based fluorescence immunoassays for the detection of tumor-induced proteins
Abstract
In 2002 lung cancer was diagnosed in over 45 000 persons, 39 000 fatalities were registered. According to these statistics, lung cancer prognosis is one of the poorest. Main reason for is the late detection due to diagnosis via optical methods by which a tumor cannot be found till 300 to 400 days after incidence. In contrast, autoantibodies against tumorsuppressor p53 can be detected in blood serum 100 days after tumor development. As a diagnosis in this early stage is supposed to result in successful therapy in 80 percent of the cases. Hence, these antibodies are promising candidates in research of tumor markers. The antibodies are expected to be found in persons with mutated p53, but can be detected by standard ELISA in only about 40 percent of the persons with a diagnosed lung cancer although a p53 mutation is found in 65 percent. In this work a new immunoassay based on fluorescence tracing of p53 antibodies for the detection of lung cancer from human blood sera is presented. The fluorescence microscopic detection of antibodies against p53 by a sandwich method using peptide epitopes of the tumorsuppressor was successfully performed for three epitopes of which one was known to be immunodominant. For this peptide 12 out of 19 sera from lung cancer patients (63 percent) showed a significant reaction towards the peptides, whereas only 2 out of 21 healthy donor sera (10 percent) were tested positive. Two other peptides were equal apart from acetylation of one lysine within the sequence, that occurs in vivo as a reaction to DNA-damage. In contrast to the epitope mentioned above, both of them evoked significant responses from healthy donors' sera, but the non acetylated one was hardly detected in cancer patients' sera. It could be shown that, depending on the considered epitope, healthy individuals produce antibodies against tumorsuppressor p53, too. The sensitivity of the assay is about three times higher than the available ELISAs. Furthermore the new technique allows performance in less than three hours from undiluted sera and hence is less labor intensive. In contrast to standard ELISA, the new assay detects specifically antibodies against certain epitopes of the p53 protein. Hence it was possible to distinguish between epitopes that can be found in healthy blood donors and such ones, that are predominantly found in patients with lung cancer. The observed differences in the responses towards the two related epitopes proof, that posttranslational modifications are different in healthy individuals and cancer patients. As the new technique allows observation of in vivo p53 modification, it gives a tool for a deeper understanding of p53 regulation and tumor development.

2002 erkrankten in Deutschland etwa 45.000 Menschen an Lungenkrebs, rund 39.000 starben daran. Damit haben Patienten, die an dieser Krebsart erkrankt sind, nach solchen mit Bauchspeicheldrüsenkrebs und Speiseröhrenkrebs die schlechteste Heilungsprognose [Robert-Koch-Institut 2006]. Einer der Gründe hierfür ist, dass die Diagnose ausschließlich über bildgebende Diagnostik möglich ist. Da die Krankheit im frühen Stadium keine Beschwerden hervorruft, werden bösartige Veränderungen häufig erst gefunden, wenn die Tumorbildung schon weit fortgeschritten ist und sich Metastasen gebildet haben. Seit den neunziger Jahren werden Antikörper gegen den Tumorsuppressor p53 auf eine Funktion als globale Tumormarker hin untersucht, da bereits früh eine Korrelation zwischen vielen Krebserkrankungen und der Bildung dieser Antikörper nachgewiesen wurde. Veränderungen im Protein selber können in 67 Prozent der Lungenkrebspatienten nachgewiesen werden. Über den p53-ELISA, die derzeitige Standardmethode zum Nachweis seiner Antikörper, können jedoch nur in etwa 20 Prozent der Patienten Antikörper gegen das p53-Protein nachgewiesen werden. Eine Erhöhung dieses Anteils würde einen Nachweis zur Detektion von p53-Autoantikörpern im Rahmen der Krebsvorsorge sinnvoll machen. In dieser Arbeit wurde ein hochempfindlicher, beadbasierter Assay zum Nachweis von p53-Antikörpern entwickelt. Dieser ist mit 2 Stunden deutlich schneller als der ELISA, vermeidet unspezifische, adsorptive Reaktionsschritte sowie enzymatische Verstärkung des Signals und ist nicht auf einen Vergleich mit Standardproben angewiesen. Unter der Annahme, dass minimale Konzentrationen von p53-Antikörpern auch in gesunden Spendern zu finden sind, wurde auf die Verwendung des Gesamtproteins als Antigen verzichtet. Es wurden verschiedene immunodominante Epitope daraufhin untersucht, ob gesunde und Krebsseren unterschiedliche Reaktionen auf sie zeigen. Hierbei konnte festgestellt werden, dass verschiedene Epitope unterschiedlich auf gesunde Seren und solche von Spender mit einer diagnostizierten Krebserkrankung reagieren. Besonders ausgeprägt war der Unterschied in der Reaktivität bei einem, bereits als immunodominant bekannten, N-terminalen Epitop. Gegen dieses konnten in 65 Prozent der Krebsseren Antikörper nachgewiesen werden, währen nur 10 Prozent der gesunden Spender positiv reagierten. Auch wenn eine genaue Bestimmung der Detektionsgrenze nicht möglich ist, konnte festgestellt werden, dass der in dieser Arbeit entwickelte Nachweis deutlich empfindlicher als ein ELISA ist. Während dieser die niedrigen Antikörperkonzentrationen in Seren gesunder Spender nicht nachweisen kann, konnten mit dem entwickelten Assay je nach Epitop in bis zu 45 Prozent der Spender Antikörper nachgewiesen werden. Es gibt zwei Gründe für die erhöhte Sensitivität des neuen, fluoreszenzbasierten Nachweises. Durch den Verzicht auf einen adsorptiven Reaktionsschritt kann das Blutserum unverdünnt eingesetzt werden, ohne das Hintergrundsignal signifikant zu beeinflussen. Zu einer erhöhten Sensitivität trägt außerdem bei, dass der im Rahmen dieser Arbeit entwickelte Nachweis nur zwei Inkubationsschritte mit den zugehörigen Waschschritten benötigt, während es im p53-ELISA vier sind. Die Vielfältigkeit des entwickelten Nachweises zeigt sich daran, dass einfache Modifikationen in der Versuchsführung eine genaue quantitative Bestimmung von Plasmaproteinen erlaubt. Das Ziel dieses zweiten Assays war es, einen quantitativen Nachweis zu entwickeln, der empfindlich genug für die Bestimmung von Plasmaproteinen wie IGF-I ist und ohne Waschschritte durchgeführt werden kann. In monoklonalen Experimenten konnte gezeigt werden, dass der Assay mit großer Genauigkeit die Konzentration von IGF angibt und bei einer Nachweisdauer von einer Stunde um ein vielfaches schneller als die derzeit im Laboralltag zum IGF-Nachweis verwendeten semiquantitativen ELISAs ist.
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Scheffler S. Bead-basierte Fluoreszenz-Immunoassays zum Nachweis tumorinduzierter Proteine. Bielefeld (Germany): Bielefeld University; 2007.
Scheffler, S. (2007). Bead-basierte Fluoreszenz-Immunoassays zum Nachweis tumorinduzierter Proteine. Bielefeld (Germany): Bielefeld University.
Scheffler, S. (2007). Bead-basierte Fluoreszenz-Immunoassays zum Nachweis tumorinduzierter Proteine. Bielefeld (Germany): Bielefeld University.
Scheffler, S., 2007. Bead-basierte Fluoreszenz-Immunoassays zum Nachweis tumorinduzierter Proteine, Bielefeld (Germany): Bielefeld University.
S. Scheffler, Bead-basierte Fluoreszenz-Immunoassays zum Nachweis tumorinduzierter Proteine, Bielefeld (Germany): Bielefeld University, 2007.
Scheffler, S.: Bead-basierte Fluoreszenz-Immunoassays zum Nachweis tumorinduzierter Proteine. Bielefeld University, Bielefeld (Germany) (2007).
Scheffler, Silvia. Bead-basierte Fluoreszenz-Immunoassays zum Nachweis tumorinduzierter Proteine. Bielefeld (Germany): Bielefeld University, 2007.
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