Rekombinante Expression von humanen Xylosyltransferasen in der methylotrophen Hefe Pichia pastoris und in dem Bakterium Escherichia coli

Carrera Casanova J (2008)
Bielefeld (Germany): Bielefeld University.

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Bielefeld Dissertation | German
Author
Supervisor
Kleesiek, Knut (Prof. Dr. med.)
Abstract
UDP-D-xylose: proteoglycan-core-protein [beta]-D-xylosyltransferase (EC 2.4.2.26, XylT) initiates the biosynthesis of glycosaminoglycan chains in proteoglycans by transferring xylose from UDP-xylose to specific serine residues of a core protein. Xylosyltransferase II (XylT-II) is a protein homologue to XylT-I, whose enzymatic activity was recently identified. In this study, the putative catalytic domain of XylT-II was heterologously expressed in the methylotrophic yeast Pichia pastoris. It was produced as a soluble active protein and biochemically characterized. The substrate specificity for various acceptors was investigated and a modified bikunin peptide was shown to be the optimal XylT-II acceptor (K_M = 1.9 µM). The core protein/sugar-linkage type, the influence of nucleotide derivatives, the temperature optimum, the stability, the monofunctionality and the ion-dependency were investigated and among others the necessity for magnesium and manganese ions for the enzymatic activity was confirmed. An inhibition of XylT-II by its biosynthesis pathway end products in particular heparin was detected and an influence of basic proteins like histones and protamines was figured out. The in-gel detection through purification of xylosyltransferase II was achieved from 40 liters P. pastoris-supernatant by a combination of ammonium sulphate precipitation, heparin affinity chromatography and ion exchange chromatography. With a final yield of 3 per cent, the protein was purified over 7000-fold compared to the original protein sample. The purified product was identified as XylT-II by mass spectra. Further the heparin-binding sequence of xylosyltransferase II should be identified. Prerequisite for that was the production of a sufficient amount of purified protein. Because XylT-I binds independently of its structure to heparin, E. coli was chosen to produce soluble fusion proteins consisting of the solubility enhancement protein maltose-binding-protein (MBP) and XylT-II fragments. The fusion proteins were purified and the binding to heparin was analysed. Although the binding of various XylT-II fragments was immunologically detected, sufficient purified protein could not be produced for further analysis due to the fact that the codon usage of the human XylT-II mRNA was not optimized for proper E. coli processing.

UDP-D-Xylose: Proteoglykan-Core-Protein [beta]-D-Xylosyltransferase (EC 2.4.2.16, XylT) initiiert die Biosynthese von Glykosaminoglykan-Seitenketten in Proteoglykanen durch den Transfer der Xylose von UDP-Xylose auf spezifische Serinreste eines Core-Proteins. Die Xylosyltransferase II (XylT-II) stellt ein XylT-I-paraloges Protein dar, dessen enzymatische Aktivität erst vor kurzem bestätigt werden konnte. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die vermeintliche katalytische Domäne der XylT-II erstmals in der methylotrophen Hefe Pichia pastoris heterolog als lösliches, funktionelles Protein produziert und biochemisch charakterisiert. Es wurde die Substratspezifität für diverse potentielle Akzeptoren untersucht und ein modifiziertes Bikunin-Peptid als optimaler XylT-II Akzeptor (K_M 1,9 µM) bestimmt. Die Core-Protein/Zucker-Konfiguration, der Einfluss von Nukleotid-Derivaten, das Temperaturoptimum, die Stabilität, die Monofunktionalität und die Ionenabhängigkeit wurden untersucht und dabei u.a. die Notwendigkeit für bivalente Mg^2+ - und Mn^2+ -Ionen für die enzymatische Aktivität ermittelt. Es wurde eine Inhibition der XylT-II durch Stoffwechselweg-Endprodukte, vornehmlich durch Heparin festgestellt und eine Einflussnahme basischer Proteine wie Histone und Protamine eruiert. Die XylT-II konnte aus 40 Liter P. pastoris-Kulturüberstand durch eine Kombination von Ammoniumsulfat-Fällung, Heparin-Affinitätschromatographie und Ionenaustausch-Chromatographie aufgereinigt werden. Bei einer Gesamtausbeute von 3 Prozent wurde hierbei über eine 7000fache Aufreinigung des Enzyms erreicht und das Produkt massenspektrometrisch als XylT-II identifiziert. Als weiteres Projekt sollte die Heparin-bindende Aminosäuresequenz der XylT-II identifiziert werden. Voraussetzung dafür war die Herstellung einer ausreichenden Menge an gereinigtem Protein. Aufgrund der strukturunabhängigen Bindung von XylT-I an Heparin wurden in E. coli u.a. lösliche XylT-II-Fragmente als Fusionsproteine mit einem MBP-Affinitäts-Tag (Maltose-Binde-Protein) produziert, gereinigt und anschließend deren Heparin-Bindung analysiert. Dabei wurde immunologisch festgestellt, dass zwar eine Bindung verschiedener XylT-II-Fragmente vorhanden war, allerdings konnte wegen des nicht für E. coli optimierten Codon-Gebrauchs in der humanen XylT-II mRNA keine ausreichende Menge für die weiteren Analysen hergestellt werden.
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Carrera Casanova J. Rekombinante Expression von humanen Xylosyltransferasen in der methylotrophen Hefe Pichia pastoris und in dem Bakterium Escherichia coli. Bielefeld (Germany): Bielefeld University; 2008.
Carrera Casanova, J. (2008). Rekombinante Expression von humanen Xylosyltransferasen in der methylotrophen Hefe Pichia pastoris und in dem Bakterium Escherichia coli. Bielefeld (Germany): Bielefeld University.
Carrera Casanova, J. (2008). Rekombinante Expression von humanen Xylosyltransferasen in der methylotrophen Hefe Pichia pastoris und in dem Bakterium Escherichia coli. Bielefeld (Germany): Bielefeld University.
Carrera Casanova, J., 2008. Rekombinante Expression von humanen Xylosyltransferasen in der methylotrophen Hefe Pichia pastoris und in dem Bakterium Escherichia coli, Bielefeld (Germany): Bielefeld University.
J. Carrera Casanova, Rekombinante Expression von humanen Xylosyltransferasen in der methylotrophen Hefe Pichia pastoris und in dem Bakterium Escherichia coli, Bielefeld (Germany): Bielefeld University, 2008.
Carrera Casanova, J.: Rekombinante Expression von humanen Xylosyltransferasen in der methylotrophen Hefe Pichia pastoris und in dem Bakterium Escherichia coli. Bielefeld University, Bielefeld (Germany) (2008).
Carrera Casanova, Javier. Rekombinante Expression von humanen Xylosyltransferasen in der methylotrophen Hefe Pichia pastoris und in dem Bakterium Escherichia coli. Bielefeld (Germany): Bielefeld University, 2008.
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