Entwicklung eines Produktionsprozesses zur Herstellung rekombinanten humanen Wachstumshormons

Nottorf T (2006)
Bielefeld (Germany): Bielefeld University.

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Bielefeld Dissertation | German
Author
Supervisor
Lehmann, Jürgen (Prof. Dr.-Ing.)
Abstract
Das humane Wachstumshormon hat ein großes Anwendungsspektrum, wobei die aktuell hohen Kosten der Therapie seinen breiteren Einsatz und wirksamere, höhere Dosierungen verhindern. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die Entwicklung eines kostengünstigen Produktionsprozesses für rekombinantes humanes Wachstumshormon (Somatropin) mit einer CHO-Zelllinie. Hierzu wurde neben einem Perfusionsprozess eine Produktaufreinigungssequenz entwickelt, sowie eine Produktanalytik etabliert. Der Perfusionsprozess erreichte in einem 2 L-Bioreaktor bei einer Lebendzelldichte von 2,4·10^7 Zellen/mL einen Produktausstoß von über 1000 mg rhGH pro Tag. Dies war möglich, weil durch eine gezielte Variation der Kulturbedingungen die zellspezifischen Verdünnungsraten auf ein Sechstel des Ausgangswerts reduziert werden konnten. Dabei wurde die Kultivierungstemperatur auf 33 °C und der pH-Wert zur Minimierung der Lactatbildung auf 6,95 reduziert. Durch die effizientere Mediumsnutzung wurden höhere Produktkonzentrationen bei geringeren Perfusionsraten ermöglicht. Auch die Produktqualität war bei eingeschalteter Perfusion stets hoch. Der zur Zellrückhaltung eingesetzte Plattensedimenter erlaubte eine selektive Abtrennung der kleineren, toten Zellen. Bei hohen Zelldichten wurden verstärkt Zellaggregate gebildet, die vom Plattensedimenter ebenfalls zurückgehalten wurden. Durch eine Erhöhung des Leistungseintrags konnte die Aggregationsquote nur geringfügig reduziert werden. Da die Zellentnahmepumpe über die Reglerausgangsgrößen des pO2-Reglers geregelt wurde (Oxystat), konnte die Produktkonzentration trotzdem konstant gehalten werden. Für einen Austrag von Zellaggregaten über die Oxystat-geregelte Zellentnahme musste die spezifische Wachstumsrate ausreichend hoch sein. Ein multimodaler Ligand wurde zur Primäraufreinigung des Perfundats im Fließbett benutzt. Bei der Nutzung als Kationenaustauscher bei pH-Werten oberhalb des isoelektrischen Punkts konnte natives Produkt mit Ausbeuten bis zu 70 Prozent gewonnen werden. Das humane Wachstumshormon wurde nach der Primäraufreinigung in einer Sequenz von drei weiteren Chromatographieschritten aufgereinigt. Mit der Hydrophoben Interaktionschromatographie wurde die 20 kDa-Variante selektiv abgereichert und eine chemische Virusinaktivierung durchgeführt. In der folgenden Anionenaustauschchromatographie wurde das Produkt weiter aufgereinigt und konzentriert. Die abschließende Größenausschlusschromatographie diente der Abreicherung von Dimeren und der Umpufferung des Produkts. In Bezug auf den Anteil nicht-desamidierten Produkts, den Dimeranteil, die dsDNA-Konzentration und die Menge an Wirtszellprotein genügte das Produkt den regulatorischen Bestimmungen schon nach der Anionenaustauschchromatographie. Die biologische Wirksamkeit des hergestellten Produkts wurde im Tierversuch mit Ratten und im in-vitro-Experiment mit Nb2-Zellen belegt. Die Zelllinie wurde negativ auf die Kontamination mit Viren und Mycoplasmen getestet. Sie hatte eine hohe spezifische Produktbildungsrate, die im Perfusionsprozess ohne Selektionsdruck langzeitstabil war.
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Nottorf T. Entwicklung eines Produktionsprozesses zur Herstellung rekombinanten humanen Wachstumshormons. Bielefeld (Germany): Bielefeld University; 2006.
Nottorf, T. (2006). Entwicklung eines Produktionsprozesses zur Herstellung rekombinanten humanen Wachstumshormons. Bielefeld (Germany): Bielefeld University.
Nottorf, T. (2006). Entwicklung eines Produktionsprozesses zur Herstellung rekombinanten humanen Wachstumshormons. Bielefeld (Germany): Bielefeld University.
Nottorf, T., 2006. Entwicklung eines Produktionsprozesses zur Herstellung rekombinanten humanen Wachstumshormons, Bielefeld (Germany): Bielefeld University.
T. Nottorf, Entwicklung eines Produktionsprozesses zur Herstellung rekombinanten humanen Wachstumshormons, Bielefeld (Germany): Bielefeld University, 2006.
Nottorf, T.: Entwicklung eines Produktionsprozesses zur Herstellung rekombinanten humanen Wachstumshormons. Bielefeld University, Bielefeld (Germany) (2006).
Nottorf, Tobias. Entwicklung eines Produktionsprozesses zur Herstellung rekombinanten humanen Wachstumshormons. Bielefeld (Germany): Bielefeld University, 2006.
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