Kraftspektroskopie und Einzelmoleküldetektion mit der Optischen Pinzette

Sischka A (2005)
Bielefeld (Germany): Bielefeld University.

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OA
Bielefeld Dissertation | German
Author
Supervisor
Anselmetti, Dario (Prof. Dr.)
Alternative Title
Force spectroscopy and single molecule detection with optical tweezers
Abstract
A compact, single beam optical tweezers system for force measurements and manipulation of individual double-stranded DNA (dsDNA) molecules was integrated into a commercial inverted optical microscope. A maximal force of 350 pN combined with a force sensitivity of less than 0.5 pN allows measurements of elastic properties of single molecules which complements and overlaps the force regime accessible with atomic force microscopy (AFM). The manipulation and measurement performance of this system was tested with individual Lambda DNA molecules and renders new aspects of dynamic forces phenomena with higher precision in contrast to AFM studies. An integrated liquid handling system with a fluid cell allows investigation of the force response of individual DNA molecules in the presence of DNA binding agents. Mechanical properties of double-stranded DNA (dsDNA) in the presence of different binding ligands were analyzed in optical tweezers experiments with sub-piconewton force resolution. Different binding modes could unambiguously be distinguished by analyzing the mechanic response of a dsDNA molecule to an applied external force. We compared the effects of the minor groove binder distamycin-A, a major groove binding alpha-helical peptide, the intercalator ethidium bromide, YO-1 and daunomycin as well as the bisintercalator YOYO-1 on Lambda DNA. Binding of molecules to the minor and major groove to dsDNA induces distinct changes in the molecular elasticity compared to the free dsDNA detectable as a shift of the B-S transition to higher forces. Intercalating molecules affect the molecular mechanics by a complete disappearance of the B-S transition and an associated increase in molecular contour length. Significant force hysteresis effects occurring during stretching/relaxation cycles with velocities in the range between 100 nm/s and 12,000 nm/s were found for daunomycin YOYO-1. These time dependent mechanical properties directly reflect the kinetics of the binding and unbinding. Force dependent time constants of 0.29 - 1.34 s and 0.15 - 0.60 s were determined for YOYO-DNA complexes and daunomycin-DNA complexes, respectively. Also we used the optical tweezer setup as an optiomechanical force transducer to analyze the rupture forces between mouse anti-chicken immunoglobulin class M (Anti-IgM) coupled to the surface of a trapped bead and membrane-bound B-cell receptors (immunoglobulin class M) on living chicken DT40 B-cells. The experiment exhibits specific single and multiple bond interactions and dissociations when an external force was applied. At a loading rate of 45 pN/s a single bond rupture force of 12.5 pN and integer multiples of this value during multiple bond rupturing could be identified. These experiments will allow interesting and important in-vitro testing of living cells in the future.

Sowohl die Untersuchung der Elastizität kettenförmiger Polymere, die Charakterisierung der Bindung kleiner Moleküle, wie beispielsweise Peptide und Proteine, an eine DNA als auch Kraftmessungen zwischen Liganden und Rezeptoren in oder auf den verschiedensten biologischen Systemen, unter anderem mit der Zielsetzung, Kinetik, Gleichgewichtszustände, strukturelle Charakteristika oder Details der Energielandschaft der Bindungen zu beschreiben - sie alle verlangen nach äußerst sensitiven Kraftmessmethoden. Die beiden prominentesten Techniken sind hierbei die AFM-Kraftspektroskopie und die Optische Pinzette, die parallel zu ihrer überragenden Kraftauflösung auch weit in den Bereich der höheren Kräfte des AFMs vordringen kann. Das Prinzip der Optischen Pinzette basiert auf einem stark fokussierten Laserstrahl, der es ermöglicht, eine dreidimensionale Optische Falle - oder auch Photonisches Potential - zu generieren. Darin können Objekte der Größe einzelner Atome bis hin zu mehreren Dutzend Mikrometern gefangen werden. Das gezielte Fangen und Bewegen von Objekten mit Hilfe der Optischen Falle stellt nur eine Facette der Möglichkeiten dieses Systems dar. Weitaus verfeinerter sind die Mittel, das gefangene Objekt als einen Sensor für äußere Kräfte in dessen unmittelbarer Umgebung zu benutzen. Hierbei können die Auslenkungen des Objektes - welches bei den meisten biophysikalisch relevanten Untersuchungen ein transparentes Kügelchen ist - in eine Kraft übersetzt werden. Im Gegensatz zum AFM, bei dem für Kraftmessungen biochemisch präparierte Oberflächen benötigt werden, kann sich bei der Optischen Pinzette beispielsweise dem zu untersuchenden Objekt von mehreren Seiten beliebig angenähert werden, da das gefangene Objekt frei im Raum bewegt werden kann. Die gezielte biochemische Präparation des gefangenen Objektes eröffnet außerdem die Möglichkeit, die zu charakterisierenden Systeme, wie Makromoleküle oder Proteine, selektiv zu immobilisieren und diese dann gezielt in Kontakt zu bringen mit weiteren zu untersuchenden Molekülen. In dieser Arbeit werden lokale Viskositätsmessungen in Gegenwart von Grenzflächen durchgeführt. Eine weitere Fragestellung ist die Messung von Kräften an intrazellulären Systemen der Signalweiterleitung sowie das noch relativ unerforschte Gebiet der Kraftspektroskopie der Optischen Pinzette an lebenden Zellen. Vorrangigste Untersuchungsgebiete sind jedoch die mechanischen Eigenschaften von doppelsträngigen DNA-Molekülen (in Abhängigkeit von äußeren Parametern) und die Veränderung der Charakteristika in Abhängigkeit von schwach oder unspezifisch bindenden Liganden. Unterschiedlichste Bindungsmoden konnten identifiziert und differenziert werden und quantitative Aspekte der Elastizität jener Komplexe beschrieben werden. Die bislang nahezu kaum charakterisierte Kinetik der Bindungen jener Liganden an dsDNA stellte ein weiteres Untersuchungsgebiet dar. Dies ermöglichte wiederum Rückschlüsse auf konformative und zeitliche Änderungen der Bindung von Liganden an DNA.
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Sischka A. Kraftspektroskopie und Einzelmoleküldetektion mit der Optischen Pinzette. Bielefeld (Germany): Bielefeld University; 2005.
Sischka, A. (2005). Kraftspektroskopie und Einzelmoleküldetektion mit der Optischen Pinzette. Bielefeld (Germany): Bielefeld University.
Sischka, A. (2005). Kraftspektroskopie und Einzelmoleküldetektion mit der Optischen Pinzette. Bielefeld (Germany): Bielefeld University.
Sischka, A., 2005. Kraftspektroskopie und Einzelmoleküldetektion mit der Optischen Pinzette, Bielefeld (Germany): Bielefeld University.
A. Sischka, Kraftspektroskopie und Einzelmoleküldetektion mit der Optischen Pinzette, Bielefeld (Germany): Bielefeld University, 2005.
Sischka, A.: Kraftspektroskopie und Einzelmoleküldetektion mit der Optischen Pinzette. Bielefeld University, Bielefeld (Germany) (2005).
Sischka, Andy. Kraftspektroskopie und Einzelmoleküldetektion mit der Optischen Pinzette. Bielefeld (Germany): Bielefeld University, 2005.
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