Entwicklung und Einsatz eines spezifischen Peptid-Affinitätsliganden für die fließbettchromatographische Aufreinigung eines Proteins aus Säugetierzellkulturen

Ameskamp NM (2001)
Bielefeld (Germany): Bielefeld University.

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OA
Bielefeld Dissertation | German
Author
Supervisor
Lehmann, Jürgen (Prof. Dr.-Ing.)
Abstract
Die Arbeit beschäftigt sich mit der Entwicklung einer spezifischen Peptid-Affinitätsmatrix für die Proteinaufreinigung in der Fließbettchromatographie. Durch die Auswahl universell einsetzbarer Techniken gelang es, eine auf beliebige Zellkulturprodukte übertragbare Vorgehensweise zu etablieren. Mit dem neuartigen Chromatographiematerial wurden die hochselektiven Bindungseigenschaften eines Affinitätsgels mit der hohen Stabilität gruppenspezifischer Matrices vereint und ein erfolgreicher Fließbettprozess verwirklicht, der sich durch eine hohe Reproduzierbarkeit und einen hervorragenden Reinigungs- und Klärungserfolg auszeichnete. Die Methodenentwicklung erfolgte exemplarisch anhand eines Modellproteins. Hierbei handelte es sich um einen aus Maus/Maus Hybridomkulturen gewonnenen monoklonalen Antikörper, der gegen den Blutgerinnungsfaktor VIII gerichtet war. Die zugrundeliegenden Studien gliederten sich in die Suche nach einem geeigneten Peptidliganden, die Entwicklung einer optimalen Strategie für die Fixierung an die Basalmatrix und die ausführliche Charakterisierung des Aufreinigungsverhaltens in der Fest- und Fließbettchromatographie. Die Selektionierung des Peptidliganden erfolgte mit kombinatorischen gerasterten Teilbibliotheken aus linearen Hexapeptiden, die mittels Spot-Synthese auf Cellulosemembranen hergestellt wurden. Durch den Einsatz einer zweipositionalen Suchstrategie (XX12XX; X1CD2X; 1BCDE2) gelang es, in nur drei Selektionszyklen eine hochaffine Sequenz für die Bindung des Antikörpers zu ermitteln. Anschließend wurden anhand von kleinen Festbettsäulen (1 ml HiTrap-NHS) drei verschiedene Kupplungsmethoden entwickelt. Durch spezielle Modifikationen der Basalmatrix und der Peptidsequenz konnte eine zur Spot-Synthese analoge gezielte Verknüpfung über den C-Terminus realisiert werden, die eine optimale Ligandenzugänglichkeit in der Chromatographie gewährleistete. Die Ergebnisse aus den festbettchromatographischen Experimenten zeigten, dass sich alle verwendeten Kupplungsstrategien zur Herstellung einer funktionstüchtigen Peptid-Affinitätsmatrix eigneten. Die Bindungs- und Wiederfindungsraten lagen in sämtlichen Aufarbeitungsläufen über 97 v.H. mit Produktausbeuten von mehr als 96 v.H. Die Matrices bewiesen eine für affinitätschromatographische Prozesse charakteristische Selektivität, was zu einer entsprechend hohen Reinheit der Produkteluate führte. In SDS-PAGE Analysen konnten keine kontaminierenden Fremdproteine nachgewiesen werden und die DNA-Abreicherung betrug unter Berücksichtigung des methodisch bedingten Detektionslimits von 10 ng/ml in allen Fällen mehr als 99,994 v.H. Ferner zeichneten sich die Peptidmatrices durch eine äußerst hohe Stabilität aus, die eine unkomplizierte Regeneration von 0,5 molarer Natronlauge erlaubte. Da die drei Testsäulen selbst hinsichtlich der Bindungskapazität von mehr als 25 mg IgG/ml Gel keine signifikanten Unterschiede in ihrer chromatographischen Leistung aufwiesen, wurde sich bei der Herstellung der großvolumigeren Fließbettmatrix für die bezüglich des Zeit- und Materialaufwands am besten zu kalkulierende Kupplungsmethode entschieden. Dabei handelte es sich um die direkte Peptidsynthese an das Chromatographiematerial, die sich zudem durch ihre besonders universelle Einsetzbarkeit auszeichnete. In der Fließbettadsorption wurde mit einer Matrixschüttung von 70 ml bis zu 1800 ml Kultursuspension innerhalb von 90 bis 120 Minuten erfolgreich prozessiert. Die Aufreinigungserfolge waren mit denen aus der Festbettchromatographie vergleichbar und wiesen eine hohe Reproduzierbarkeit auf. Der Vergleich mit herkömmlichen Fließbettmedien zeigte, dass die Peptid-Affinitätsmatrix sowohl bezüglich der Abreicherung von Kontaminationen als auch hinsichtlich der Wechselwirkungen mit der Biomasse die gleichen selektiven Bindungseigenschaften wie das kommerziell erhältliche rProtein A Gel aufwies. In allen Fällen konnte die Biomasse um mehr als 99,6 v.H. auf weniger als 18 nl/ml reduziert werden. Am Beispiel der fließbettchromatographischen Aufreinigung des monoklonalen Antikörpers wurde gezeigt, dass der Einsatz von Peptidliganden als eine wertvolle und vielversprechende Alternative für herkömmliche Matrices eingestuft werden kann.
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Ameskamp NM. Entwicklung und Einsatz eines spezifischen Peptid-Affinitätsliganden für die fließbettchromatographische Aufreinigung eines Proteins aus Säugetierzellkulturen. Bielefeld (Germany): Bielefeld University; 2001.
Ameskamp, N. M. (2001). Entwicklung und Einsatz eines spezifischen Peptid-Affinitätsliganden für die fließbettchromatographische Aufreinigung eines Proteins aus Säugetierzellkulturen. Bielefeld (Germany): Bielefeld University.
Ameskamp, N. M. (2001). Entwicklung und Einsatz eines spezifischen Peptid-Affinitätsliganden für die fließbettchromatographische Aufreinigung eines Proteins aus Säugetierzellkulturen. Bielefeld (Germany): Bielefeld University.
Ameskamp, N.M., 2001. Entwicklung und Einsatz eines spezifischen Peptid-Affinitätsliganden für die fließbettchromatographische Aufreinigung eines Proteins aus Säugetierzellkulturen, Bielefeld (Germany): Bielefeld University.
N.M. Ameskamp, Entwicklung und Einsatz eines spezifischen Peptid-Affinitätsliganden für die fließbettchromatographische Aufreinigung eines Proteins aus Säugetierzellkulturen, Bielefeld (Germany): Bielefeld University, 2001.
Ameskamp, N.M.: Entwicklung und Einsatz eines spezifischen Peptid-Affinitätsliganden für die fließbettchromatographische Aufreinigung eines Proteins aus Säugetierzellkulturen. Bielefeld University, Bielefeld (Germany) (2001).
Ameskamp, Nicole Melanie. Entwicklung und Einsatz eines spezifischen Peptid-Affinitätsliganden für die fließbettchromatographische Aufreinigung eines Proteins aus Säugetierzellkulturen. Bielefeld (Germany): Bielefeld University, 2001.
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