Entwicklung eines MMP-13-ELISAs zur Untersuchung pathophysiologischer Prozesse

Hantke B (2003)
Bielefeld (Germany): Bielefeld University.

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Bielefeld Dissertation | German
Author
Supervisor
Tschesche, Harald (Prof. em. Dr.)
Abstract
Ausgehend von einem etablierten E.coli-Expressionssystem wurde die Proform der katalytischen Domäne der Kollagenase-3 (Leu1-Gly248) exprimiert und ein bestehendes Isolierungs- und Reinigungsverfahren verwendet (Oberpichler, 1999). Das auf diese Weise gereinigte Protein diente als Antigen zur Herstellung mono- und polyklonaler Antikörper. Diese Antikörper stellten ihre hohe Spezifität bei der Isolierung nativer MMP-13 aus Aszitesflüssigkeit von Patientinnen mit fortgeschrittenem Ovarialkarzinom mittels einer neuentwickelten, universell einsetzbaren Affinitätschromatographie unter Beweis. Die Identifizierung der isolierten Kollagenase-3 erfolgte durch Western-Blot und MALDI-TOF-Massenspektrometrie. Im Mittelpunkt dieser Arbeit stand die Entwicklung eines MMP-13-ELISAs. Mit Hilfe der mono- und polyklonalen MMP-13-Antikörper konnte ein Sandwich-ELISA-System aufgebaut werden, dessen Zuverlässigkeit durch eine Reihe statistischer Tests nachgewiesen wurde. Mit einer Sensitivität von 0,5 ng/ml wurde der ELISA erfolgreich zur Bestimmung der Konzentration dieser Protease in Gewebe bzw. Gewebeflüssigkeiten bei verschiedenen pathologischen Prozessen eingesetzt. Während bei einem Kollektiv von Brusttumorgewebe keine Korrelation der klinischen Symptome mit der MMP-13-Konzentration gefunden wurde, zeigte sich ein Zusammenhang zwischen dem Krankheitsbild und der Konzentration dieses Enzyms in prothesenahem Gewebe bei aseptischer Hüftprothesenlockerung (Diehl et al., 2003) ebenso wie in Aszitesflüssigkeit von Patientinnen mit Ovarialkarzinom (Hantke et al., 2003). Bei der letztgenannten Untersuchung wurden die polyklonalen MMP-13-Antikörper weiterhin zur Laser-Scanning-Mikroskopie von Tumorzellen in der Aszitesflüssigkeit eingesetzt. Da ein signifikanter Zusammenhang zwischen der MMP-13-Konzentration in der Aszitesflüssigkeit und der Überlebenszeit der Patientinnen zu bestehen scheint, der jedoch anhand eines größeren Kollektivs noch zweifelsfrei nachgewiesen werden muss, lässt sich diskutieren, ob MMP-13 als prognostischer Marker in Aszitesflüssigkeit beim Ovarialkarzinom dienen kann. Eine weitere Anwendung fand der MMP-13-ELISA bei einer in vitro-Untersuchung zur lichtinduzierten Hautalterung. Dabei wurde die MMP- und TIMP-Expression humaner dermaler Fibroblasten (HDF), die sowohl in Monolayern als auch eingebettet in einem Kollagen-Gel kultiviert wurden, nach UVA-Strahlung untersucht (Hantke et al., 2002). Unter dem Einfluss der zugesetzten Vitamine C und E sowie der Flavonoide AGR ([alpha]-Glucosylrutin) und 8PN (8-Prenylnaringenin) wurden die Genexpression von MMP-1 und TIMP-1, die Proteinexpression von MMP-1, -2, -8, -9, -12, -13, TIMP-1 und TIMP-2 sowie die Enzymaktivität von MMP-1 und MMP-2 bestimmt. Dabei wurden MMP-8, -9, -12 und MMP-13 von den HDF allerdings unter keiner der gewählten Versuchsbedingungen exprimiert. Für MMP-1 und MMP-2 zeigte sich, dass sowohl die Vitamine C und E als auch AGR die Expression und Aktivität dieser beiden Proteasen nach UVA-Bestrahlung deutlich reduzierten, während 8PN interessanterweise den gegenteiligen Effekt erzielte. Dabei veränderte keine der zugesetzten Substanzen die TIMP-Konzentrationen signifikant. Somit bietet neben den Vitaminen C und E vor allem AGR, das die Kollagenase-Expression der bestrahlten HDF um 60 v.H. reduzierte, eine gute Möglichkeit, der durch UV-Bestrahlung stark erhöhten MMP-Aktivität in der Haut entgegenzuwirken und damit der vorzeitigen Hautalterung vorzubeugen.
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Hantke B. Entwicklung eines MMP-13-ELISAs zur Untersuchung pathophysiologischer Prozesse. Bielefeld (Germany): Bielefeld University; 2003.
Hantke, B. (2003). Entwicklung eines MMP-13-ELISAs zur Untersuchung pathophysiologischer Prozesse. Bielefeld (Germany): Bielefeld University.
Hantke, B. (2003). Entwicklung eines MMP-13-ELISAs zur Untersuchung pathophysiologischer Prozesse. Bielefeld (Germany): Bielefeld University.
Hantke, B., 2003. Entwicklung eines MMP-13-ELISAs zur Untersuchung pathophysiologischer Prozesse, Bielefeld (Germany): Bielefeld University.
B. Hantke, Entwicklung eines MMP-13-ELISAs zur Untersuchung pathophysiologischer Prozesse, Bielefeld (Germany): Bielefeld University, 2003.
Hantke, B.: Entwicklung eines MMP-13-ELISAs zur Untersuchung pathophysiologischer Prozesse. Bielefeld University, Bielefeld (Germany) (2003).
Hantke, Bernd. Entwicklung eines MMP-13-ELISAs zur Untersuchung pathophysiologischer Prozesse. Bielefeld (Germany): Bielefeld University, 2003.
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