Aufdeckung der räumlichen Wechselwirkungen einzelner Biomoleküle mittels Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer (FRET) und alternierender Laseranregung

Roß J (2006)
Bielefeld (Germany): Bielefeld University.

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OA
Bielefeld Dissertation | German
Author
Supervisor
Sauer, Markus (Prof. Dr.)
Abstract
Die in dieser Arbeit vorgestellte Methode der dreifach alternierenden Laseranregung (TrALEx) stellt eine Erweiterung der Einzelmolekül-Fluoreszenzmikroskopie dar. Der Einsatz mehrerer Anregungswellenlängen erlaubt es, unterschiedlich fluoreszierende Sonden simultan zur Erforschung der Zusammensetzung oder räumlichen Wechselwirkungsmöglichkeiten im Rahmen von FRET z.B. an Biomolekülen einzusetzen. Mit der entwickelten Methode lassen sich: - Räumliche Anordnungen innerhalb einzelner Moleküle / Molekülkomplexe abfragen. - Bindungen an komplexen Molekülen / Molekülaggregaten studieren. - Zeitliche Strukturveränderungen molekularer Aggregate nachweisen. - Subpopulationen in einer heterogenen Probe selektiv auswerten. - Konkurrierende Energietransferpfade auflösen. - Lecks z.B in einem gerichteten FRET über mehrere Stationen aufdecken. - Abstände jenseits des zweifarbigen FRET bestimmen. Die alternierende Laseranregung wurde mit einem akusto-optischen Filter (AOTF) bewerkstelligt, der aus den Linien eines Multiline-Lasers die jeweilige Wellenlänge selektiert. Die für die Charakterisierung notwendigen Proben für gerichteten Energietransfer und Energietransfer mit drei beliebigen Transferpfaden wurden sowohl mit klassischer Ensemblespektroskopie als auch mit der auf TrALEx erweiterten Einzelmolekülfluoreszenzmikroskopie untersucht. Ein Vergleich der Daten mit herkömmlicher Einzelmolekülmikroskopie, mit nur einer anregenden Wellenlänge, deckte wesentliche Informationen über die Transferpfade des FRET bei beiden Proben auf. Es konnten Abstände zwischen mehreren Farbstoffen bestimmt werden, selbst wenn die Energietransferpfade konkurrieren. Aufgrund der zusätzlichen Anregungswellenlängen wurden für einige Farbstoffe Indizien für weiter zu untersuchende photophysikalische Effekte gefunden. Den zweiten Schwerpunkt dieser Dissertation bildet die partielle Strukturauflösung des heterogenen Proteinkomplexes der vakuolären H+ -ATPase. Dieser Komplex aus zwölf unterschiedlichen Proteinen wurde mit Methoden aus der Ensemblespektroskopie und der Einzelmolekülspektroskopie untersucht. Bindungsstudien auf Einzelmolekülebene des chaotropen Salzen ausgesetzten Proteinkomplexes konnten eindrucksvoll belegen, dass sich dieser nach Dialyse teilweise reassembliert. Es wurde der Nachweis erbracht, dass statistisches Markieren von Molekülkomplexen einen Zugang zur Struktur und Zusammensetzung von Biomolekülen bilden kann. Mit dieser Methode konnte die Integration der heterolog exprimierten Untereinheit E in den solubilisierten Gesamtkomplex nachgewiesen werden. Ebenso wurde die Annahme einer Dimerisierung der Untereinheit E und ihr zweifaches Vorkommen im Gesamtkomplex in vitro in Frage gestellt.
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Roß J. Aufdeckung der räumlichen Wechselwirkungen einzelner Biomoleküle mittels Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer (FRET) und alternierender Laseranregung. Bielefeld (Germany): Bielefeld University; 2006.
Roß, J. (2006). Aufdeckung der räumlichen Wechselwirkungen einzelner Biomoleküle mittels Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer (FRET) und alternierender Laseranregung. Bielefeld (Germany): Bielefeld University.
Roß, J. (2006). Aufdeckung der räumlichen Wechselwirkungen einzelner Biomoleküle mittels Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer (FRET) und alternierender Laseranregung. Bielefeld (Germany): Bielefeld University.
Roß, J., 2006. Aufdeckung der räumlichen Wechselwirkungen einzelner Biomoleküle mittels Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer (FRET) und alternierender Laseranregung, Bielefeld (Germany): Bielefeld University.
J. Roß, Aufdeckung der räumlichen Wechselwirkungen einzelner Biomoleküle mittels Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer (FRET) und alternierender Laseranregung, Bielefeld (Germany): Bielefeld University, 2006.
Roß, J.: Aufdeckung der räumlichen Wechselwirkungen einzelner Biomoleküle mittels Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer (FRET) und alternierender Laseranregung. Bielefeld University, Bielefeld (Germany) (2006).
Roß, Joachim. Aufdeckung der räumlichen Wechselwirkungen einzelner Biomoleküle mittels Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer (FRET) und alternierender Laseranregung. Bielefeld (Germany): Bielefeld University, 2006.
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