Zelluläre Funktionsstudien zum Wirkungsmechanismus von Shiga Toxinen bei mikro- und makrovaskulären Endothelzelllinien

Bauwens A (2010)
Bielefeld (Germany): Bielefeld University.

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OA
Bielefeld Dissertation | German
Author
Supervisor
Müthing, Johannes ; Karch, Helge
Abstract
Enterohämorrhagische Escherichia coli, die humanpathogene Subgruppe der Shiga Toxin-produzierenden E. coli, verursachen nicht-blutige und blutige Diarrhö, HC und das lebensbedrohliche HUS. HUS resultiert aus der mikrovaskulären Endothelzellschädigung von Nieren, Gehirn und anderen Organen. Stx, die Hauptvirulenzfaktoren der EHEC, bestehen aus einer enzymatisch aktiven A-Untereinheit und fünf identischen B-Untereinheiten. Die Familie der Stx umfasst zwei Hauptgruppen, Stx1 und Stx2, welche 53 bzw. 64 Prozent Sequenzidentität in ihrer A- bzw. B-Untereinheit aufweisen. Nach der Freisetzung der Stx durch die EHEC im Lumen des Gastrointestinaltraktes gelangen diese über den Blutkreislauf zu ihrem Wirkungsort, den kapillaren Endothelzellen. Dort binden die Toxine an die zellulären Rezeptoren, werden internalisiert und intrazellulär retrograd prozessiert. Im Zytosol wirkt das katalytisch aktive A1-Fragment durch spezifische Depurinierung von Adenosin der hochkonservierten 60S-rRNA toxisch. Dies führt zur Inhibition der Proteinbiosynthese und zum Zelltod. Neben diesem zytotoxischen Effekt wurden weitere Wirkungen von Stx auf Zellen beschrieben, beispielsweise die Depurinierung von chromosomaler DNA, die Umorganisation des Zytoskelettes und die Induktion von Apoptose. Im Rahmen dieser Dissertation wurden die zytotoxischen Effekte von Stx1 und Stx2 auf humane mikro- und makrovaskuläre Endothelzellen untersucht. Mit Hilfe von Zellproliferations- und Zytotoxizitätsassays konnten konzentrationsabhängig unterschiedliche Sensitivitäten der beiden Zelllinien gegenüber den Toxinen festgestellt werden. Hierbei konnte gezeigt werden, dass mikrovaskuläre im Vergleich zu makrovaskulären Zellen besonders sensitiv auf Stx2 reagieren. Dies deckt sich mit den Beobachtungen der zerebralen Schädigung im Patienten, da meist solche EHEC-Stämme mit schweren klinischen Verläufen assoziiert werden können, die Stx2 produzieren. Um einen genaueren Einblick in die Mechanismen der Zytotoxizität zu erlangen, wurden SEM-Aufnahmen von konfluenten Zellmonolayern auf MC vor und nach Toxinbehandlung angefertigt. Während Stx1 eine Verringerung der Anzahl von Mikrovilli-Strukturen auf der Zelloberfläche, irreguläre Zellformen, Läsionen der Plasmamembran, Ausbildung von Membrankörperchen (das sog. blebbing) und Lücken im Zellmonolayer durch Zellablösung verursacht, sind nach Inkubation mit Stx2 lediglich eine leicht veränderte Form der Zellen sowie blebbing zu beobachten. Diese morphologischen Untersuchungen, insbesondere das Ausbleiben von nekrotischen Effekten wie Membranläsionen oder Zellablösung in Stx2-behandelten Endothelzellen, führten zu der Hypothese, dass Stx1 sowohl Nekrose als auch Apoptose, Stx2 hingegen hauptsächlich Apoptose induziert. Zur Verifizierung dieser verschiedenen Mechanismen wurde eine Methode basierend auf DHM etabliert, um HBMECs und EA.hy 926 Zellen einer Einzelzell-Analyse zu unterziehen. Die Visualisierung der Nekrose nach Inkubation mit Stx1 zu unterschiedlichen Zeitpunkten bestätigt die differentielle Sensitivität mikro- und makrovaskulärer Endothelzellen. Zusätzlich lässt sich der Prozess der Nekrose dreidimensional quantifizieren. Bei Experimenten mit Stx2 konnte keine Nekrose beobachtet werden, allerdings auch keine Zellteilung trotz einer verlängerten Experimentaldauer. Um einen durch Stx verursachten Zellzyklus-Arrest auszuschließen, wurden Zellzyklusstudien mit Hilfe der Durchflusszytometrie durchgeführt. Da kein signifikanter Zellzyklus-Arrest durch Stx verursacht wird, muss die Teilungsinaktivität der Zellen auf einer Induktion der Apoptose durch Stx2 beruhen. Dies konnte mittels DNA-Fragmentierungsassays bestätigt und die Effekte konzentrationsabhängig quantifiziert werden. Da die in dieser Arbeit untersuchten differentiellen Effekte von Stx1 und Stx2 nicht auf die bisher beschriebenen Wirkungsweisen von Stx zurückzuführen sind, muss angenommen werden, dass hier ein oder mehrere bisher unbeschriebene Mechanismen zugrunde liegen. Des Weiteren wurde die Inhomogenität von HBMECs und EA.hy 926 Zellen in Kultur mit DHM, IF und Durchflusszytometrie untersucht. Dabei konnten variierende nekrotische Todeszeitpunkte der Zellen beobachtet und die Frage negiert werden, ob die Menge des Zelloberflächen-assoziierten Rezeptors mit der Empfindlichkeit der Zellen gegenüber Stx in Zusammenhang steht. Zudem wurde gezeigt, dass die Expression von Gb3Cer nicht Zellzyklus-abhängig ist. Die in dieser Dissertation entwickelten Methoden wurden zudem eingesetzt, um einen weiteren Virulenzfaktor der EHEC, EHEC-Vac, zu charakterisieren. Die Verwendung der IF zeigte, dass die EHEC-Vac-bedingten Vakuolen lysosomalen Ursprungs sind. Final war die Inkubation der Zellen mit EHEC-Vac letal. Die Art des Zelltodes und Hinweise auf die Dynamik der Vakuolenbildung konnten mit Langzeitmessungen im DHM bestimmt werden.
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Bauwens A. Zelluläre Funktionsstudien zum Wirkungsmechanismus von Shiga Toxinen bei mikro- und makrovaskulären Endothelzelllinien. Bielefeld (Germany): Bielefeld University; 2010.
Bauwens, A. (2010). Zelluläre Funktionsstudien zum Wirkungsmechanismus von Shiga Toxinen bei mikro- und makrovaskulären Endothelzelllinien. Bielefeld (Germany): Bielefeld University.
Bauwens, A. (2010). Zelluläre Funktionsstudien zum Wirkungsmechanismus von Shiga Toxinen bei mikro- und makrovaskulären Endothelzelllinien. Bielefeld (Germany): Bielefeld University.
Bauwens, A., 2010. Zelluläre Funktionsstudien zum Wirkungsmechanismus von Shiga Toxinen bei mikro- und makrovaskulären Endothelzelllinien, Bielefeld (Germany): Bielefeld University.
A. Bauwens, Zelluläre Funktionsstudien zum Wirkungsmechanismus von Shiga Toxinen bei mikro- und makrovaskulären Endothelzelllinien, Bielefeld (Germany): Bielefeld University, 2010.
Bauwens, A.: Zelluläre Funktionsstudien zum Wirkungsmechanismus von Shiga Toxinen bei mikro- und makrovaskulären Endothelzelllinien. Bielefeld University, Bielefeld (Germany) (2010).
Bauwens, Andreas. Zelluläre Funktionsstudien zum Wirkungsmechanismus von Shiga Toxinen bei mikro- und makrovaskulären Endothelzelllinien. Bielefeld (Germany): Bielefeld University, 2010.
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