Kooperation funktioneller Domänen des Adapterproteins SLP-65 für die Ca2+-Antwort in B-Lymphocyten

Herrmann N (2009)
Bielefeld (Germany): Bielefeld University.

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Bielefeld Dissertation | German
Author
Supervisor
Wienands, Jürgen (Prof. Dr.)
Abstract
Specific antigen recognition by B cells is mediated via their antigen receptor (BCR), resulting in several intracellular signaling events. The recruitment of the Ca^2+ initiation complex, consisting of SLP-65, PLC-[gamma]2 and Btk, to the plasma membrane is a key element of BCR signal transduction. The exact mechanism of this SLP-65 mediated localization remains obscure. In 2005 the N-terminus of SLP-65 was described as an important component and a leucine-zipper function was postulated. However, I could show by targeted inactivation of this motif, that a leucine-zipper is not responsible for the correct subcellular organisation of the Ca^2+ initiation complex. The function depended rather on the basic characteristics of this region, which I name basic effector domain (BED). Furthermore, I could identify Calmodulin as a new BED-dependent binding partner of SLP-65. Ca^2+ concentration-dependent interaction studies, as well as Ca^2+ mobilization kinetics of cells expressing SLP-65 variants that do not bind Calmodulin, suggest a function downstream of the Ca^2+ mobilization. However, the importance of BED for the membrane localization of SLP-65 could be attributed to a different aspect. I showed a BED-mediated interaction of SLP-65 directly with lipid components of cell membranes in vitro, namely phosphatidylinositol-phosphates (PIP). I confirmed the functional relevance in vivo showing that the defined PIP binding motif of the adaptor protein TIRAP can fully substitute BED. This suggests that a direct interaction of BED with PIP is involved in membrane localization of SLP-65 and thus of the Ca^2+ initiation complex. I also contributed to the functional understanding of the SH2 domain as the second essential component for membrane recruitment of SLP-65. By co-expression of SLP-65 variants lacking BED or SH2 domain, I could show an in cis cooperation of these domains. To characterize this in more detail chimeric SLP-65 variants were generated, in which BED was replaced by various membrane recruitment domains. Additional inactivation of the SH2 domain within these proteins allowed analysis of an individual function of the SH2 domain. The results demonstrated that simple membrane localization is not sufficient to substitute for both membrane anchors of SLP-65. Instead, the protein must localize specifically to BCR-proximal signalling compartments within membrane microdomains. This is mediated by the SH2 domain. The results show that membrane recruitment of SLP-65 underlies a complex mechanism requiring the concerted function of at least two domains. The model I propose is, that BED contributes to SLP-65 membrane recruitment by direct PIP-binding and together with the SH2 domain stabilizes SLP-65 at the plasma membrane by a two-armed anchoring. The SH2 domain additionally mediates a specific localization of the protein, and therefore the Ca^2+ initiation complex, in defined signalling platforms, the lipid rafts.

Die spezifische Antigenerkennung durch B-Zellen erfolgt über deren Antigenrezeptor (BCR) und resultiert in einer Reihe intrazellulärer Signale. Ein Schlüsselelement der BCR-Signalleitung ist die Rekrutierung des Ca^2+-Initiationskomplexes, bestehend aus SLP-65, PLC-[gamma]2 und Btk, an die Plasmamembran. Der genaue Mechanismus dieser SLP-65-vermittelten Lokalisation ist bislang unklar. Als wichtige Komponente wurde im Jahr 2005 die N-terminale Region von SLP-65 beschrieben und eine Leucin-Zipper-Funktion postuliert. Durch gezielte Inaktivierung des zugehörigen Motivs konnte ich jedoch zeigen, dass ein Leucin-Zipper nicht für die korrekte subzelluläre Organisation des Ca^2+-Initiationskomplexes verantwortlich ist. Stattdessen habe ich die Funktion auf die basischen Eigenschaften dieser Region zurückgeführt und sie als basische Effektordomäne (BED) bezeichnet. Des Weiteren konnte ich Calmodulin als neuen Bindungspartner der BED identifizieren. Ca^2+-konzentrationsabhängige Interaktionsstudien zusammen mit Ca^2+-Mobilisierungskinetiken in Zellen, welche unterschiedliche, nicht mehr mit Calmodulin interagierende SLP-65-Varianten exprimieren, lassen eine der Ca^2+-Mobilisierung nachgeschaltete Funktion vermuten. Die Bedeutung der BED für den Mechanismus der Membranlokalisation konnte ich einem anderen Aspekt zuordnen. So habe ich eine direkte, BED-vermittelte Interaktion von SLP-65 mit Lipidbestandteilen von Zellmembranen, nämlich Phosphatidylinositolphosphaten (PIP), in vitro nachgewiesen. Die funktionelle Relevanz konnte ich in vivo bestätigen, denn das bekannte PIP-Bindemotiv des Adapterproteins TIRAP konnte die BED funktionell ersetzen. Dies legt nahe, dass die BED durch direkte Interaktion mit PIP zur Membranlokalisation des Ca^2+-Initiationskomplexes beiträgt. Ferner konnte ich zum funktionellen Verständnis der SH2-Domäne von SLP-65 als zweite, essentielle Komponente für die Membranrekrutierung beitragen. Durch Koexpression von SLP-65-Varianten, denen BED oder SH2-Domäne fehlen, konnte ich eine in cis Kooperation beider Domänen zeigen. Um diese näher zu charakterisieren, wurden SLP-65-Chimären, bei denen BED durch verschiedene Membranrekrutierungsdomänen substituiert war, generiert. Kombiniert mit der Inaktivierung der SH2-Domäne innerhalb dieser Proteine, war die Analyse einer individuellen Funktion der SH2-Domäne möglich. Die Ergebnisse zeigten, dass eine einfache Membranlokalisation nicht ausreicht, um beide Membrananker zu ersetzen, sondern das Protein darüber hinaus in BCR-nahe Signalzentren in Membranmikrodomänen lokalisiert werden muss. Hierfür ist die SH2-Domäne verantwortlich. Die Studien zeigen, dass die Membranrekrutierung von SLP-65 einem komplexen Mechanismus unterliegt, der die konzertierte Funktion mindestens zweier Domänen benötigt. Mein Modell schlägt vor, dass BED durch eine direkte PIP-Bindung zur Membranrekrutierung von SLP-65 beiträgt und zusammen mit der SH2-Domäne in einer zweiarmigen Verankerung das Protein an der Plasmamembran stabilisiert. Die SH2-Domäne bestimmt darüber hinaus die konkrete Lokalisation des Proteins, und damit des Ca^2+-Initiationskomplexes, in definierten Signalplattformen, den lipid rafts.
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Herrmann N. Kooperation funktioneller Domänen des Adapterproteins SLP-65 für die Ca2+-Antwort in B-Lymphocyten. Bielefeld (Germany): Bielefeld University; 2009.
Herrmann, N. (2009). Kooperation funktioneller Domänen des Adapterproteins SLP-65 für die Ca2+-Antwort in B-Lymphocyten. Bielefeld (Germany): Bielefeld University.
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Herrmann, N., 2009. Kooperation funktioneller Domänen des Adapterproteins SLP-65 für die Ca2+-Antwort in B-Lymphocyten, Bielefeld (Germany): Bielefeld University.
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Herrmann, N.: Kooperation funktioneller Domänen des Adapterproteins SLP-65 für die Ca2+-Antwort in B-Lymphocyten. Bielefeld University, Bielefeld (Germany) (2009).
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