Identifizierung von Interaktionspartnern und Funktion des N-Terminus des Qb-SNAREs Vti1p in Saccharomyces cerevisiae und Produktion von Channelrhodopsin-2 in Pichia pastoris

Arndt M (2009)
Bielefeld (Germany): Bielefeld University.

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Bielefeld Dissertation | German
Author
Supervisor
Fischer von Mollard, Gabriele (Prof. Dr.)
Abstract
In the first project of this thesis possible interaction partners with the N-terminus of the Qb-SNARE Vti1p should be identified using the tandem affinity purification (TAP) method. Interaction partners were identified by MALDI-TOF mass spectrometry. Five potential interacting proteins could be identified by using the MASCOT database, YCL058W-A, YLL033W, YOL045W, YKR001C and YJL082W. Beside these proteins a number of non-native proteins were detected, i.e. chaperones and cytosolic enzymes. YCL058W-A is a protein with unknown function. Two variants of this protein exist: YCL058W-A and YCL058C. By modification of this protein with a HA-tag it was possible to co-precipitate these proteins with Vti1p-TAP showing a weak interaction. This interaction was confirmed by a Yeast-2-Hybrid assay. YLL033W codes for a protein with unknown function. By tagging it with HA a weak interaction was detectable by co-precipitation with Vti1p-TAP. This result was confirmed by a Y-2-H assay. The next candidate was YOL045W, a gene which encodes a serine/threonine kinase and is involved in the sugar metabolism. It was not possible to clarify an interaction with Vti1p. Another candidate was YKR001C. It encodes a protein which acts as a dynamin-like GTPase and is involved in cargo transport into the vacuole and cytoskeleton organisation. The interaction could not be verified by a Y-2-H assay. The last interacting candidate was YJL082W. It encodes for a protein with unknown function. It was detected in mitochondria. An interaction was not detectable by a Y-2-H assay. In a second project N-terminal truncated Vti1p-mutants should be localised by microscopy to investigate a possible effect on intracellular localisation. The mutants were modified with HA-, GFP- and eGFP-tags. Compartments were stained for co-localisation. It could be shown, that a deletion of the complete N-terminus leads to a mislocalisation to the plasmamembrane and an accumulation in punctured structures within the cytosol. The partly deleted mutant and the wild type showed a localisation of tagged Vti1p around the vacuole and into the vacuole. It could be concluded that the N-terminus has a function as a sorting- or recruiting-signal for Vti1p. The third project was a cooperation between the groups of BCIII and PCIII. It dealt with the efficient expression of the light-inducible cation channel protein Channelrhodopsin-2 in the methylotrophic yeast Pichia pastoris. The protein was modified with a RGS-6HIS-tag for efficient purification by affinity chromatography. The purified protein was destined for functional analysis by IR-spectroscopy. To analyse the function of Channelrhodopsin-2 in more detail, single amino acid mutants were created to study their influence on Channelrhodopsin-2 function.

Im ersten Projekt dieser Arbeit sollten Interaktionspartner des N-Terminus des Qb-SNAREs Vti1p mithilfe der TAP (tandem affinity purification)-Methode und anschließender MALDI-TOF Massenspektrometrie identifiziert werden. Nach der Optimierung der TAP-Methode für Vti1p konnten fünf potentielle Interaktionspartner nachgewiesen werden. Zusätzlich konnte die bekannte Interaktion zwischen Vti1p und Ent3p mithilfe der TAP-Aufreinigung und erstmalig durch eine Co-Präzipitation bestätigt werden. Dieses Experiment diente zur Überprüfung, ob die erhaltenen Ergebnisse aus der TAP-Methode valide sind. Es wurden folgende fünf Kandidaten nach einer MASCOT-Datenbankabfrage identifiziert: YCL058W-A, YLL033W, YOL045W, YKR001C und YJL082W. Daneben wurden viele nicht-nativ wechselwirkende Proteine, wie z.B. Chaperone und Enzyme des Cytosols nachgewiesen. Bei YCL058W-A handelt es sich um ein Protein mit unbekannter Funktion. Es existieren zwei Varianten dieses Proteins YCL058W-A und YCL058C. Durch die Modifikation des Proteins mit einem HA-tag konnte durch eine Co-Präzipitation mit Vti1p-TAP eine schwache Interaktion nachgewiesen werden, diese wurde durch einen anschließenden Yeast-2-Hybrid Assay bestätigt. Das Gen YLL033W kodiert für ein Protein mit unbekannter Funktion. Durch die Modifikation mit einem HA-tag, nachfolgender Co-Präzipitation mit Vti1p-TAP und Validierung durch einen Y-2-H Assay wurde eine schwache Wechselwirkung nachgewiesen. Ein weiterer Kandidat war Psk2p. Dieses Protein ist eine Serin/Threonin-Kinase und ist am Zuckermetabolismus beteiligt. Eine Interaktion mit Vti1p konnte mittels Y-2-H Assays nicht bestätigt werden. Als weiterer Interaktionspartner wurde das Vps1p identifiziert. Dieses Protein ist eine Dynamin-ähnliche GTPase und ist an dem Transport von Cargo in die Vakuole sowie an der Organisation des Cytoskeletts beteiligt. Ein Nachweis einer Interaktion mit Vti1p konnte mithilfe eines Y-2-H Assays nicht erbracht werden. Der fünfte identifizierte Interaktionspartner war das Gen YJL082W. Eine Funktion für das kodierte Protein Iml2p ist derzeit nicht bekannt und es wurde vornehmlich in Mitochondrien detektiert. Eine Interaktion mit Vti1p konnte durch einen Y-2-H Assay nicht bestätigt werden. Im zweiten Projekt sollten N-terminal trunkierte Vti1p-Mutanten mikroskopisch untersucht werden, um einen möglichen Einfluss des N-Terminus auf die intrazelluläre Lokalisierung festzustellen. Hierzu wurden verschiedene Modifikationen an den Proteinvarianten durchgeführt (HA-, GFP- und eGFP-tag) sowie Färbungen von Kompartimenten vorgenommen, um eine Co-Lokalisierung zu ermöglichen. Bei der Mutante, dessen N-Terminus etwa zur Hälfte intakt war, sowie beim Wildtyp zeigte sich eine Verteilung an die Vakuole, bzw. in die Vakuole. Es zeigte sich, dass bei der Mutante, der der N-Terminus fehlt, eine Lokalisierung zur Plasmamembran sowie in punktierten Strukturen innerhalb der Zelle auftrat. Die Deletion der Aminosäuren M1 bis Q54 hat keinen Einfluss auf die zelluläre Lokalisierung von Vti1p. Daraus kann geschlossen werden, dass der N-Terminus eine mögliche Sortierungs- bzw. Rekrutierungsfunktion aufweist. Beim dritten Projekt handelt es sich um ein Kooperationsprojekt zwischen den Arbeitsgruppen BCIII und PCIII. Das licht-induzierbare Kationkanalprotein Channelrhodopsin-2 wurde in hoher Ausbeute in der methylotrophen Hefe Pichia pastoris produziert. Für die Affinitätschromatographie wurde das Protein mit einem zusätzlichen RGS-6HIS-tag versehen, um für anschließende, spektroskopische Funktionsuntersuchungen in genügender Reinheit vorzuliegen. Zusätzlich wurden gezielte Einzelaminosäure-Mutanten des Proteins erzeugt, um den Einfluss von strukturell wichtigen Aminosäuren auf die Funktion des Channelrhodopsins-2 zu untersuchen.
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Arndt M. Identifizierung von Interaktionspartnern und Funktion des N-Terminus des Qb-SNAREs Vti1p in Saccharomyces cerevisiae und Produktion von Channelrhodopsin-2 in Pichia pastoris. Bielefeld (Germany): Bielefeld University; 2009.
Arndt, M. (2009). Identifizierung von Interaktionspartnern und Funktion des N-Terminus des Qb-SNAREs Vti1p in Saccharomyces cerevisiae und Produktion von Channelrhodopsin-2 in Pichia pastoris. Bielefeld (Germany): Bielefeld University.
Arndt, M. (2009). Identifizierung von Interaktionspartnern und Funktion des N-Terminus des Qb-SNAREs Vti1p in Saccharomyces cerevisiae und Produktion von Channelrhodopsin-2 in Pichia pastoris. Bielefeld (Germany): Bielefeld University.
Arndt, M., 2009. Identifizierung von Interaktionspartnern und Funktion des N-Terminus des Qb-SNAREs Vti1p in Saccharomyces cerevisiae und Produktion von Channelrhodopsin-2 in Pichia pastoris, Bielefeld (Germany): Bielefeld University.
M. Arndt, Identifizierung von Interaktionspartnern und Funktion des N-Terminus des Qb-SNAREs Vti1p in Saccharomyces cerevisiae und Produktion von Channelrhodopsin-2 in Pichia pastoris, Bielefeld (Germany): Bielefeld University, 2009.
Arndt, M.: Identifizierung von Interaktionspartnern und Funktion des N-Terminus des Qb-SNAREs Vti1p in Saccharomyces cerevisiae und Produktion von Channelrhodopsin-2 in Pichia pastoris. Bielefeld University, Bielefeld (Germany) (2009).
Arndt, Marius. Identifizierung von Interaktionspartnern und Funktion des N-Terminus des Qb-SNAREs Vti1p in Saccharomyces cerevisiae und Produktion von Channelrhodopsin-2 in Pichia pastoris. Bielefeld (Germany): Bielefeld University, 2009.
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