Klonierung, Expression und Charakterisierung einzelner Domänen der Gelatinasen

Stute J (2002)
Bielefeld (Germany): Bielefeld University.

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OA
Bielefeld Dissertation | German
Author
Supervisor
Tschesche, Harald (Prof. em. Dr.)
Abstract
Die Matrix Metalloproteinasen, eine Familie von Zink-abhängigen Enzymen, degradieren in Kombination alle Komponenten der extrazellulären Matrix. Daher haben sie in vielen physiologischen und pathologischen Prozessen, wie z.B. Wachstum, Wundheilung, rheumatoide Arthritis und Tumormetastasierung, entscheidende Bedeutung. Im Rahmen dieser Arbeit sollten für unterschiedliche Domänen der Gelatinasen A und B (MMP-2 und MMP-9) Expressionssysteme etabliert und die rekombinanten Proteine weiter charakterisiert werden. Für die Fibronektin-ähnliche Domäne der Gelatinase A stand ein etabliertes Expressionssystem in E. coli zur Verfügung (Stute 1998). Hierauf aufbauend wurde diese Domäne im Großmaßstab exprimiert und mittels RedOx-"shuffling"-System und Affinitätschromatographie an Gelatin-Sepharose aktiviert und gereinigt. Durch dieses effiziente Verfahren konnten mehrere Chargen mit unterschiedlichen Pufferzusammensetzungen für die Kristallisation und Röntgenstrukturanalyse bereitgestellt werden. Um den Einfluss einer Glykosylierung auf die Stabilität der katalytischen Domäne der Gelatinase B zu evaluieren, konnte ein Expressionssystem in Pichia pastoris erfolgreich etabliert werden. Hierfür wurde mittels PCR die codierende cDNA amplifiziert und nach Subklonierung in E. coli das Genfragment in den Hefe-Expressionsvektor pPICZ[alpha]A einkloniert. Nach erfolgreicher Transformation verschiedener Pichia pastoris Stämme konnte die Expression der gewünschten Domäne mittels Western-Blot nachgewiesen werden. Parallel zur Wildtyp-Form der katalytischen Domäne wurde ebenfalls eine potentiell inaktive Mutante (Glu383Gln, Leu399Ala) kloniert und exprimiert. Die Expressionsanalyse zeigte bei beiden Varianten sowohl die Expression des gewünschten Monomers als auch die eines Dimers. Ein Aktivitätstest mittels Gelatin-Zymogramm wies eine Substratdegradierung für die Wildtyp-Form und die Mutante aus. Die autoproteolytische Degradierung während der Reinigung mittels Ionenaustauschchromatographie und Gelfiltration verdeutlicht den nicht ausreichenden Schutz der Glykosylierung für die Stabilität der rekombinanten Domäne. Für die Hämopexin-ähnlichen Domänen der Gelatinasen A und B (Häm-GelA und Häm-GelB) wurden Expressionssysteme in Pichia pastoris erfolgreich etabliert. Mittels PCR wurden die codierenden cDNAs amplifiziert und im Anschluss an eine Subklonierung in E. coli die Genfragmente in den Hefe-Expressionsvektor pPICZ[alpha]A einkloniert. Nach erfolgreicher Transformation verschiedener Pichia pastoris Stämme konnte die Expression der gewünschten Domänen mittels SDS-PAGE und N-terminaler Aminosäuresequenzierung nachgewiesen werden. Zur Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen den Hämopexin-ähnlichen Domänen und den "tissue inhibitors of metalloproteinases" (TIMPs) wurde eine biomolekulare Interaktionsanalyse (BIA) durchgeführt. Die Analyse der hierbei bestimmten Assoziations- und Dissoziationskurven ergab für die Komplexe Häm-GelA/b-TIMP-2 und Häm-GelB/TIMP-1 jeweils einen zweistufigen Bindungsmechanismus. Dieses Ergebnis steht im Gegensatz zu dem von Olson et al. veröffentlichten Einstufen-Mechanismus (Olson et al. 1997), stimmt aber mit der von Morgunova et al. bestimmten Kristallstruktur des Komplexes proMMP-2/TIMP-2 überein (Morgunova et al. 2002). Parallel zur Untersuchung des Bindungsmechanismus konnten die Dissoziationskonstanten (Kd) mit 170 nM für Häm-GelA/b-TIMP-2 und 5,5 nM für Häm-GelB/TIMP-1 bestimmt werden. Hierzu ergänzend wurde eine biomolekulare Interaktionsanalyse für den Komplex proMMP-9/TIMP-1 durchgeführt. Dieses System unterscheidet sich grundlegend von den anderen. Zum einen wird dieser Komplex in einem dreistufigen Bindungsmechanismus gebildet und zum anderen zeigt der Komplex kaum eine Dissoziation. Im Gegensatz zu den bekannten Komplexen Häm-GelA/TIMP-4 und Häm-GelA/[alpha]v[beta]3-Integrin konnten keine entsprechenden Komplexe mit der Hämopexin-ähnlichen Domäne der Gelatinase B nachgewiesen werden. Weiterhin konnte keine Wechselwirkung zwischen Häm-GelB und dem [alpha]v[beta]6-Integrin identifiziert werden. Mit diesen Ergebnissen leistet die vorliegende Arbeit einen wichtigen Beitrag zum Verständnis einzelner Gelatinase-Domänen in Bezug auf Struktur, Stabilität und Interaktion mit potentiellen Bindungspartnern.
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Stute J. Klonierung, Expression und Charakterisierung einzelner Domänen der Gelatinasen. Bielefeld (Germany): Bielefeld University; 2002.
Stute, J. (2002). Klonierung, Expression und Charakterisierung einzelner Domänen der Gelatinasen. Bielefeld (Germany): Bielefeld University.
Stute, J. (2002). Klonierung, Expression und Charakterisierung einzelner Domänen der Gelatinasen. Bielefeld (Germany): Bielefeld University.
Stute, J., 2002. Klonierung, Expression und Charakterisierung einzelner Domänen der Gelatinasen, Bielefeld (Germany): Bielefeld University.
J. Stute, Klonierung, Expression und Charakterisierung einzelner Domänen der Gelatinasen, Bielefeld (Germany): Bielefeld University, 2002.
Stute, J.: Klonierung, Expression und Charakterisierung einzelner Domänen der Gelatinasen. Bielefeld University, Bielefeld (Germany) (2002).
Stute, Jörg. Klonierung, Expression und Charakterisierung einzelner Domänen der Gelatinasen. Bielefeld (Germany): Bielefeld University, 2002.
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