Bibliotheken von Stationärphasen-Promotoren in gramnegativen Bakterien : Erzeugung, Screening und verfahrenstechnische Analyse

Bettenworth F (2005)
Bielefeld (Germany): Bielefeld University.

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Bielefeld Dissertation | German
Author
Supervisor
Flaschel, Erwin (Prof. Dr.)
Abstract
Durch die Nutzung von Stationärphasen-Promotoren bzw. durch Stress induzierbare Promotoren können in der Biotechnologie vollkommen neue Möglichkeiten für die Expression rekombinanter Proteine in bakteriellen Produktionsorganismen erschlossen werden. Die Genexpression der natürlichen Promotoren ist jedoch schwach, die genetische Regulation i.d.R. komplex, und viele dieser Promotoren weisen eine hohe basale Transkription auf. Das Ziel dieser Arbeit war deshalb, die Variabilität dieser Promotoren zu vergrößern. Daher wurde eine Bibliothek von Stationärphasen-Promotoren etabliert. Um ein Modell für die Synthese dieser Promotoren zu erzeugen, wurden zuerst bioinformatische Analysen natürlicher Promotoren durchgeführt. Die Auswertung dieser Studien unter Berücksichtigung von Literaturerkenntnissen resultierte in dem Aufbau eines Modells für die Promotor-Region von -37 bis -13: TCYYGHCAAATYHNYAAWWTTGTKC. Die Promotor-DNA wurde auf 37 Nukleotide begrenzt, wovon 24 Basen zwischen -14 und -37 stromaufwärts der erweiterten -10 Region teilweise oder vollständig randomerisiert wurden. Als Modellprotein für die Charakterisierung der Promotorstärke wurde ein gentechnisch verändertes GFP mit gegenüber dem wt-GFP 45-fach verstärkter Fluoreszenz verwendet. Vornehmlich wird das LacZ-Reportersystem primär für die Untersuchung und Charakterisierung der Expressionsprofile von Genen eingesetzt. Da bisher fast ausschließlich das LacZ-Reportersystem zur Charakterisierung von Stationärphasen-Promotoren Verwendung fand, ist dieses in dieser Arbeit mit dem GFP als Reporterprotein verglichen worden. Dazu wurde ein LacZ-GFP-Expressionsvektor konstruiert. Dadurch konnte gezeigt werden, dass das gentechnisch veränderte GFP im Gegensatz zum natürlichen GFP erfolgreich zur Charakterisierung von Promotoraktivitäten eingesetzt werden kann. Das Expressionsverhalten der beiden Reportersysteme (GFP und LacZ) war sehr ähnlich. Insgesamt wurden hunderte Klone selektiert und 81 sequenziert. Die Analyse der sequenzierten Klone zeigte, dass nur 33 singuläre Sequenzen existieren. Diese wurden für weitere Expressions- und bioinformatische Studien verwendet. Für die Analyse der 33 singulären Promotorsequenzen wurden spezielle Skripte in PERL entwickelt. Eine besondere Gruppe von Promotoren zeigte eine abweichende Sequenz. Insgesamt fünf Promotoren mit dieser Konsensussequenz besitzen an der Position -35/-34 nur ein Thymin und waren dadurch charakterisiert, dass sie in einem [sigma]s-Faktor-defizienten Stamm keinerlei Promotoraktivitäten zeigten. Das heißt, dass diese Promotoren zu der Gruppe der sog. "dichten" Promotoren gehören. Damit stellen diese eine wertvolle Ausgangsbasis für das Screening weiterer "dichter" Promotoren dar. Außerdem wurde der Einfluss einer DNA-Krümmung auf die Erkennung von Stationärphasen-Promotoren untersucht. Es konnte festgestellt werden, dass die DNA-Krümmung auf die Erkennung der synthetischen Stationärphasen-Promotoren keinen Einfluss hatte. Die Stationärphasen-Promotoren der Bibliothek wiesen eine große Bandbreite von Promotoraktivitäten auf. Die Expressionshöhe der Promotoren wird entscheidend durch die Kultivierungsbedingungen beeinflusst. So wird die Expressionshöhe von der Art und dem Zustand der Vorkultur und der Größe und Art der Kulturgefäße beeinflusst. Während im Komplexmedium (LB) unter optimalen Wachstumsbedingungen der Stationärphasencharakter nachgewiesen werden konnte, war dies im Minimalmedium (M9 und MOPS) nur bei M9-Medium unter der Zugabe von sämtlichen Aminosäuren möglich. Im Gegensatz hierzu konnte der Stationärphasencharakter im MOPS-Medium trotz Zugabe sämtlicher Aminosäuren nicht nachgewiesen werden. Da GFP deutlich sensitiver als [beta]-Galaktosidase ist, konnten auch kleinere Aktivitätsänderungen detektiert werden. Diese Eigenschaft ermöglichte den Aufbau einer effektiven Screening-Methode, basierend auf der digitalen Bilderfassung. Zu diesem Zweck wurde eine speziell entwickelte semi-automatische Screeningstation konstruiert. Diese ermöglicht die Kultivierung der E. coli-Klone unter definierten Bedingungen. Weitere Untersuchungen zeigten, dass es auch möglich ist, das Expressionsverhalten natürlich gewachsener Einzelkolonien zu visualisieren und zu dokumentieren. Die Bilder konnten in benutzerdefinierten Zeitabständen aufgenommen werden. Die Auswertung der Bilder erfolgte nach folgendem Ablaufschema: Bildvorverarbeitung, Bildregistrierung, Segmentierung (Hough-Transformation bzw. Tresholding) und morphologische Operatoren. Im Anschluss erfolgte die Extraktion der Expressionsprofile. Danach wurden verschiedene Clustertechniken eingesetzt, um die Expressionsprofile der Klone weiter zu charakterisieren. Eine Clustertechnik basierte auf der Heated-Object-Scale. Mit Hilfe der hier entwickelten Methode konnten Promotoren mit unterschiedlichem Expressionsniveau und Expressionsprofil signifikant unterschieden werden.
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Bettenworth F. Bibliotheken von Stationärphasen-Promotoren in gramnegativen Bakterien : Erzeugung, Screening und verfahrenstechnische Analyse. Bielefeld (Germany): Bielefeld University; 2005.
Bettenworth, F. (2005). Bibliotheken von Stationärphasen-Promotoren in gramnegativen Bakterien : Erzeugung, Screening und verfahrenstechnische Analyse. Bielefeld (Germany): Bielefeld University.
Bettenworth, F. (2005). Bibliotheken von Stationärphasen-Promotoren in gramnegativen Bakterien : Erzeugung, Screening und verfahrenstechnische Analyse. Bielefeld (Germany): Bielefeld University.
Bettenworth, F., 2005. Bibliotheken von Stationärphasen-Promotoren in gramnegativen Bakterien : Erzeugung, Screening und verfahrenstechnische Analyse, Bielefeld (Germany): Bielefeld University.
F. Bettenworth, Bibliotheken von Stationärphasen-Promotoren in gramnegativen Bakterien : Erzeugung, Screening und verfahrenstechnische Analyse, Bielefeld (Germany): Bielefeld University, 2005.
Bettenworth, F.: Bibliotheken von Stationärphasen-Promotoren in gramnegativen Bakterien : Erzeugung, Screening und verfahrenstechnische Analyse. Bielefeld University, Bielefeld (Germany) (2005).
Bettenworth, Frank. Bibliotheken von Stationärphasen-Promotoren in gramnegativen Bakterien : Erzeugung, Screening und verfahrenstechnische Analyse. Bielefeld (Germany): Bielefeld University, 2005.
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