Untersuchungen zur Bildung Wolfram- und Rhenium-haltiger Nitrogenasen in Rhodobacter capsulatus und zur Biosynthese des FeMo-Cofaktors in einer nifE- -Mutante

Siemann S (2000)
Bielefeld (Germany): Bielefeld University.

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OA
Bielefeld Dissertation | German
Author
Supervisor
Müller, Achim (Prof. Dr. Dr. h.c.)
Abstract
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden (i) Untersuchungen zur Bildung und Identifizierung Wolfram- sowie Rhenium-haltiger Nitrogenasen in Rhodobacter capsulatus, und (ii) Untersuchungen zur Biosynthese des Eisen-Molybdän-Cofaktors der konventionellen Mo-abhängigen Nitrogenase des gleichen Organismus durchgeführt. Voruntersuchungen zum Einfluss von WO4 2-, ReO4 - und MoO4 2- auf die Nitrogenaseaktivität (C2H2-Reduktion) ergaben, dass MoO4 2- die Aktivität der Nitrogenase stimuliert, während WO4 2- die C2H2-Reduktion inhibiert. Mit ReO4 - konnte kein Einfluss auf die Nitrogenaseaktivität beobachtet werden, da ReO4 - - im Gegensatz zu MoO4 2- - nicht von den Zellen aufgenommen und somit keine Re-haltige Nitrogenase in-vivo erzeugt wurde. Eine W-haltige Nitrogenase konnte nach der Kultivierung einer anfA- -Mutante von R. capsulatus in Mo-defizientem Nährmedium in Gegenwart von WO4 2- (1 mM) isoliert und chromatographisch partiell gereinigt werden. Das isolierte Protein, in welches durchschnittlich 1 (± 0,15) W-, 16 (± 2) Fe- und 0,01 Mo-Zentren pro Protein-Tetramer eingebaut wurden (Hinweis auf die Insertion von einem FeW-Cofaktor- und einem P-Clustermolekül pro Tetramer), zeichnete sich durch eine marginale Aktivität aus. Durch detaillierte EPR-spektroskopische Charakterisierung des W-haltigen Proteins konnte ein S = 3/2-Signal (g = 4,19, 3,93, 2,01) eindeutig dem FeW-Cofaktor zugeordnet und somit der Einbau von Wolfram in den Cofaktor bewiesen werden. Die W-haltige Nitrogenase konnte nicht enzymatisch (in Gegenwart des Fe-Proteins) reduziert, d.h. in den "Turnover"-Zustand überführt werden und ist daher nicht bzw. allenfalls minimal aktiv. Im Zuge von Redoxtitrationen konnte gezeigt werden, dass der FeWco ein um mindestens 150 mV niedrigeres Halbstufenpotential besitzt als der FeMo-Cofaktor. Im Fall der P-Cluster konnte kein signifikanter Unterschied bzgl. der Potentialabhängigkeit zwischen dem P-Cluster der W-haltigen Nitrogenase und dem des nativen Enzyms beobachtet werden. Im zweiten Teil der Arbeit wurden Untersuchungen zur Biosynthese des FeMo-Cofaktors der konventionellen Nitrogenase mit einer nifE- -Mutante von R. capsulatus durchgeführt. Das Genprodukt von nifE ist in die Biosynthese des Cofaktors involviert. Im Laufe dieser Arbeit konnte demonstriert werden, dass nifE- -Zellen in der Lage sind - wenn auch mit geringerer Rate als Wildtypzellen - diazotroph zu wachsen und C2H2 nicht nur zu C2H4, sondern auch zu C2H6 zu reduzieren. Anhand von Untersuchungen an nifE- -Zellen konnte weiterhin gezeigt werden, dass (i) die in-vivo-Aktivität eine für die konventionelle Nitrogenase ungewöhnliche Abhängigkeit von der MoO4 2- -Konzentration im Nährmedium (maximale Aktivität mit 20 - 50 µM MoO4 2-) zeigt, (ii) diese jedoch nicht von der alternativen Nitrogenase von R. capsulatus herrührt, (iii) die gegenüber Wildtypzellen geringe Aktivität (5 - 15 v.H.) auf der verminderten Bildung des MoFe-Proteins beruht, (iv) die Bildung von C2H6 aus C2H2 im Extrakt von nifE- -Zellen deutlich geringer ist (ca. 1/10) als die mit ganzen Zellen gemessene. Das MoFe-Protein konnte als intaktes [alpha]2[beta]2-Tetramer isoliert (Einbau von 1,7 (± 0,2) Mo-Zentren) und der FeMoco eindeutig EPR-spektroskopisch identifiziert werden. Anhand von vergleichenden EPR-spektroskopischen Untersuchungen mit nifE- - und Wildtypzellen konnte demonstriert werden, dass sich der FeMoco in ganzen nifE- -Zellen signifikant von dem unterscheidet, der sich im Extrakt- bzw. gereinigten Protein befindet. Auf der Basis sämtlicher Ergebnisse wird ein Modell für die Cofaktor-Biosynthese vorgeschlagen.
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Siemann S. Untersuchungen zur Bildung Wolfram- und Rhenium-haltiger Nitrogenasen in Rhodobacter capsulatus und zur Biosynthese des FeMo-Cofaktors in einer nifE- -Mutante. Bielefeld (Germany): Bielefeld University; 2000.
Siemann, S. (2000). Untersuchungen zur Bildung Wolfram- und Rhenium-haltiger Nitrogenasen in Rhodobacter capsulatus und zur Biosynthese des FeMo-Cofaktors in einer nifE- -Mutante. Bielefeld (Germany): Bielefeld University.
Siemann, S. (2000). Untersuchungen zur Bildung Wolfram- und Rhenium-haltiger Nitrogenasen in Rhodobacter capsulatus und zur Biosynthese des FeMo-Cofaktors in einer nifE- -Mutante. Bielefeld (Germany): Bielefeld University.
Siemann, S., 2000. Untersuchungen zur Bildung Wolfram- und Rhenium-haltiger Nitrogenasen in Rhodobacter capsulatus und zur Biosynthese des FeMo-Cofaktors in einer nifE- -Mutante, Bielefeld (Germany): Bielefeld University.
S. Siemann, Untersuchungen zur Bildung Wolfram- und Rhenium-haltiger Nitrogenasen in Rhodobacter capsulatus und zur Biosynthese des FeMo-Cofaktors in einer nifE- -Mutante, Bielefeld (Germany): Bielefeld University, 2000.
Siemann, S.: Untersuchungen zur Bildung Wolfram- und Rhenium-haltiger Nitrogenasen in Rhodobacter capsulatus und zur Biosynthese des FeMo-Cofaktors in einer nifE- -Mutante. Bielefeld University, Bielefeld (Germany) (2000).
Siemann, Stefan. Untersuchungen zur Bildung Wolfram- und Rhenium-haltiger Nitrogenasen in Rhodobacter capsulatus und zur Biosynthese des FeMo-Cofaktors in einer nifE- -Mutante. Bielefeld (Germany): Bielefeld University, 2000.
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